基于猪体外仿生消化法研究单宁对高粱养分降解效率的影响_李旺.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：江苏省自然科学基金项目（）；中国博士后科学基金资助项目（）；江苏省博士后科研资助计划项目（）作者简介：李旺，硕士研究生。通信作者：潘龙，讲师，研究方向为饲料资源开发与应用，：。李旺，顾晓明，安冬，等 基于猪体外仿生消化法研究单宁对高粱养分降解效率的影响 南京农业大学学报，（）：，（）：基于猪体外仿生消化法研究单宁对高粱养分降解效率的影响李旺，顾晓明，安冬，李军，冯少轩，朱伟云，潘龙（南京农业大学动物科技学院消化道微生物研究室 国家动物消化道营养国际联合研究中心江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，江苏 南京）摘要：目目的的 本文旨在探究高粱单宁对高粱养分降解效率的影响。方方法法 采用单因素随机试验设计，通过猪的体外仿生消化技术模拟高粱原料在猪前段肠道中化学酶消化和后段肠道中微生物消化，在国产低单宁含量的高粱（单宁含量）原料中添加不同含量的高粱单宁提取物（单宁含量分别为、和，质量分数），每个处理设置 个重复和 个自溶（不加消化酶或不接种微生物）的空白对照。结结果果 在胃蛋白酶、胃蛋白酶胰液素或者胃蛋白酶胰液素微生物发酵作用下，随着高粱单宁添加量的增加，高粱的风干物质、总能和氮素的消失率呈现线性降低（）；且、和 处理间差异均不显著（）。在胃蛋白酶胰液素或者胃蛋白酶胰液素微生物发酵作用下，单宁组的养分消失率显著高于 处理组（），但是显著低于其他处理组（）；且模拟的线性方程系数为（）。结结论论 高粱单宁线性降低高粱养分的体外消失率，但是高粱单宁含量低于 对高粱养分的体外消失率无负面影响；在胃蛋白酶胰液素或者胃蛋白酶胰液素微生物发酵作用下，高粱单宁含量每增加，高粱养分的体外消失率平均降低 以上。关键词：高粱单宁；高粱养分；体外消失率；化学酶消化；微生物降解中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：，（），（），（），（），（）（），：；第 期李旺，等：基于猪体外仿生消化法研究单宁对高粱养分降解效率的影响玉米是我国动物的主要能量饲料原料。随着畜牧业的快速发展，我国玉米资源供不应求，缺口不断增大，价格也不断攀升。因此，可替代的能量饲料原料的开发与应用备受瞩目。高粱因具有类似玉米的营养价值和种植优势而逐渐受到大家关注。年中国动物营养指导委员会提出了猪鸡饲料玉米豆粕减量替代技术方案，其中高粱替代玉米原料位居第二。因此，高粱资源的开发与应用具有迫切的现实意义。高粱（）是我国五大谷物之一，种质资源丰富，且具有优良的种植优势，如抗旱、耐涝、耐高温、耐贫瘠、耐盐碱以及低投入高产出等。然而，我国种植的大部分高粱含有较高的单宁，本课题组前期先后测定了我国高粱主产区 多个不同品种高粱籽实的单宁含量，发现我国高粱中单宁含量变异较大，从 到，且单宁含量小于 的品种相对较少。高粱中的单宁主要是缩合单宁，其抗营养作用主要通过疏水作用力和氢键作用与其他大分子（尤其是蛋白质）形成不易被降解的蛋白质单宁复合物。本课题组前期研究已证实高粱单宁与高粱养分的猪利用效率呈显著负相关。因此，只有充分了解高粱单宁抗营养的剂量特性，才能充分利用我国低单宁甚至中单宁含量的高粱品种。目前，我国高粱在饲料中的应用仍处于摸索阶段，还没有成熟的高粱型日粮的饲用技术。实际生产中一般会根据高粱单宁含量确定高粱的添加比例。在育肥猪的饲料中，推荐高粱最大的添加比例为 单宁含量（）；在仔猪的饲料中，推荐高粱最大的添加比例为 单宁含量（）。等研究发现，在仔猪断奶后的前 周日粮中低单宁高粱替代玉米比例应低于，随后 周应低于。还有报道，深色高粱替代玉米推荐添加比例应低于。在国外，高粱型日粮较为常见，用高粱部分甚至全部替代玉米对猪的营养物质消化率无负面影响。等研究发现，喂养玉米、普通高粱或高赖氨酸高粱日粮的猪具有相似的生长性能和营养物质消化率。等研究表明，的低单宁高粱日粮对猪的生长性能和饲料转化率没有负面影响。在猪饲料中使用高粱可提高猪的瘦肉率，但是长期高比例的高粱饲喂可能会导致猪出现便秘、脱毛等现象。袁敏等研究表明，美国黄高粱全部替代玉米对育肥猪生长性能和胴体品质没有不利影响。但是，本课题组研究证实尽管用高粱替代玉米对生长猪生长性能无显著影响，但却显著降低了养分的消化率，增加了粪能和粪氮的排放量。由此说明，尽管高粱含有单宁等抗营养因子，只要寻找合适单宁含量的高粱应不会降低猪对养分的利用效率；因此，本试验拟通过体外仿生消化技术模拟高粱原料在猪胃和小肠中化学酶消化作用和大肠中微生物发酵过程，在低单宁高粱（单宁含量）原料中添加不同含量的高粱单宁提取物探究单宁对高粱养分降解效率的影响。材料与方法 试验材料选用国产低单宁含量的高粱（单宁含量为，总能为 ，粗蛋白质含量为）为试验原料，粉碎后过 筛。高粱单宁提取物（单宁含量为）由山西农业大学高粱研究所提供；猪胃蛋白酶（来源于猪胃黏膜，级，）和氯霉素（纯度）均购于上海源叶生物科技有限公司；猪胰酶（来源于猪胰腺，级，是以胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶为主的多种酶的混合物）购自上海晶纯生化科技股份有限公司。试验方法 试验设计 采用单因素随机试验设计，原料中添加不同含量（、和，质量分数）的高粱单宁提取物（高粱单宁比例为，即高粱单宁含量分别为、和，质量分数），每个处理设置 个重复和 个自溶（不加消化酶或不接种微生物）的空白对照。通过体外方法模拟猪前段消化道（胃和小肠）中消化酶（胃蛋白酶胰液素）和后段消化道（大肠）中微生物的作用，分别测定每一步后的风干物质、总能和氮素的消失率。高粱的体外酶解 胃蛋白酶降解：称取 左右高粱原料样品加入 三角瓶中，加入配制好的胃缓冲液（，）、氯霉素（，防止酶解过程中细菌增长）和胃蛋白酶（，），然后将三角瓶置于 、的摇床中。隔 用玻璃棒搅拌 次。待 后取出，用尼龙布过滤并收集残渣，然后用去离子水洗涤，将残渣放入 烘箱中烘干，称重后采集并分析样品。胃蛋白酶胰液素降解：胃蛋白酶解过程同上。经过 胃蛋白酶解后加入小肠缓冲液（，），调整 值，加入胰液素（，），酶解 后残渣用尼龙布过滤，再将残渣放入南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 烘箱中烘干，称重后采集并分析样品。高粱的体外发酵）微生物培养液配制。量取 蒸馏水于细颈瓶中，依次加入 氯化钾、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，再加入微量元素溶液（主要成分为 、和 等）、氯化血红素溶液（主要成分为 氯高铁血红素）、脂肪酸溶液（主要成分为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）各 和 刃天青、碳酸氢盐溶液，放入微波炉中加热至沸腾，通二氧化碳至常温（形成无氧环境），配制成微生物培养液。分装前加入 半胱氨酸盐酸盐，用 盐酸或 氢氧化钠调 值至 左右。）菌群接种液制备。称取 来自于 头育肥猪的盲肠结肠混合食糜于灭菌锥形瓶中，与 灭菌的 充分混合，用 层灭菌纱布过滤。在接种物的制备过程中，通入二氧化碳气体以保持厌氧状态。）体外发酵试验。称取 胃蛋白酶胰液素酶解残渣置于 发酵瓶中，每个发酵瓶中添加微生物培养液 ，加入 还原剂和 维生素磷酸盐溶液（主要成分为泛酸钙、烟酰胺和核黄素等），通入二氧化碳后迅速用橡胶塞封闭。迅速揭开橡胶塞，依次在每个发酵瓶中加入菌群接种液 ，再继续通入二氧化碳 ；然后，迅速将发酵瓶用橡胶塞塞紧，并用铝盖密封，放入已经预热至 的摇床中进行体外发酵（另取 个发酵瓶，只加入微生物培养液，作为空白对照）。发酵 后用冰袋终止发酵，再用尼龙布过滤后收集残渣，用去离子水洗涤后将残渣放入 烘箱中烘干后称重，采集样品用于营养素等指标的分析。测定指标及方法饲料和残渣中能量和粗蛋白质含量参照文献中的方法进行测定，采用氧弹式全自动量热仪测定能量；通过凯氏定氮仪进行测定粗蛋白质含量。数据处理及分析所有数据均经 软件整理后，使用 软件中 模型进行方差分析，用 测验进行多重比较。判定 水平上差异显著性。图 高粱单宁对高粱养分体外胃蛋白酶酶解消失率的影响.不同小写字母表示组间差异显著（）。下同。（）结果与分析 在胃蛋白酶作用下高粱单宁对高粱养分消失率的影响随着高粱单宁添加比例的增加，高粱风干物质、总能和氮素的消失率呈线性降低（，图）；单宁添加组的风干物质消失率显著高于 和 单宁添加组（）且与其他处理组无显著差 第 期李旺，等：基于猪体外仿生消化法研究单宁对高粱养分降解效率的影响异（）；此外，单宁添加组的总能和氮素消失率与、单宁添加组无显著差异（）。在胃蛋白酶胰液素作用下高粱单宁对高粱养分消失率的影响从图 可见：随着高粱单宁添加量的增加，高粱风干物质、总能和氮素的消失率呈线性降低（）；单宁添加组的养分消失率显著高于和组（）且与其他组无显著差异（）；单宁组的养分消失率显著高于 单宁组（），但是显著低于其他组（）；模拟的线性方程系数（），即代表高粱单宁每增加，养分的体外消失率平均降低 以上。图 高粱单宁对高粱养分体外胃蛋白酶胰液素酶解消失率的影响.图 高粱单宁对高粱养分体外胃蛋白酶胰液素微生物发酵降解效率的影响.在胃蛋白酶胰液素微生物发酵作用下高粱单宁对高粱养分消失率的影响如图 所示：在胃蛋白酶胰液素微生物发酵的作用下，随着高粱单宁添加量的增加，风干物质、总能和氮素的消失率呈线性降低（）；单宁添加组的养分消失率显著高于 和 组（）且与其他组无显著差异（）；单宁添加组的养分消失率显著高于 处理组（），但是显著低于其他处理组（）；模拟的线性方程系数为（），即代表高粱单宁每增加，养分的体外消失率平均降低 以上。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 讨论高粱单宁是一种含有酚羟基的聚合物，易与淀粉、蛋白质等营养物质结合，从而降低单胃动物对高粱养分的消化与利用。本课题组前期已证明高粱单宁与高粱养分的猪消化率呈显著负相关，因此高粱养分消失率的改变可以作为单宁是否负面影响高粱养分利用效率的指标。在本研究中，当单宁含量在 以下时，高粱风干物质、总能以及氮素的消失率均未出现显著降低现象，暗示高粱单宁含量在 以下时，对高粱的养分消化率无显著负面影响。同时，王敬尧通过绵羊瘤胃体外发酵试验研究发现，当饲料中单宁提取物含量在 以上会就显著降低绵羊瘤胃体外氮素降解率，且随着高粱单宁提取物比例的增加，干物质的降解率呈下降趋势。等对高粱单宁猪体内试验研究发现，当单宁含量为时，不会对高粱氨基酸的消化率产生负面影响，而当单宁含量高于 时对高粱蛋白质和氨基酸的消化率有显著的负面影响。在 等的研究中，在猪饲粮中添加富含单宁（单宁含量 以上）的高粱品种会降低动物的生长性能，单宁导致养分利用率下降，尤其是氮和能量利用率下降。本试验得出高粱单宁含量在 以下时，对高粱的养分消化率无显著负面影响；而当单宁含量高于 时对高粱养分消化率有显著的负面影响，这与上述前人结论基本一致。而单宁含量的不一致可能是与动物品种、高粱品种和高粱单宁测定方法有关。例如，本试验是模拟的猪体外仿生消化试验，等采用的是体内试验，而王敬尧模拟的是绵羊体外瘤胃发酵试验，或者可能是因为高粱单宁添加水平梯度设置不一致而产生了一些偏差。等研究发现，随着母牛饲料中单宁添加量的增加，母牛粪便中的氮排泄量线性增加，推测可能是单宁与饲料蛋白质通过形成复合物从而抑制蛋白质降解，而复合物不仅阻碍蛋白质降解，还可能阻碍酶促作用，最终导致粪便氮增加。因此，单宁含量过高可能会影响动物对饲料的消化，导致饲料浪费和环境污染。等研究发现，当高粱籽粒中单宁含量增加 时，猪的消化能和代谢能降低 以上，能量全肠道消化率降低 以上。等研究证实，高粱单宁每增加，高粱氮素的体外消失率下降，该试验结果与本试验结果基本相符。本试验发现，在胃蛋白酶胰液素或者胃蛋白酶胰液素微生物发酵作用下，高粱单宁每增加，养分的体外消失率平均降低 以上；推测可能是因为高粱单宁与高粱醇溶蛋白结合，而高粱醇溶蛋白又包裹着高粱淀粉颗粒，因此导致氮素和能量的消失率降低。本试验结果与 等的结论基本一致，但是 等未能研究单宁含量与养分消失率之间的具体数值关系。由于目前关于高粱单宁含量和养分利用率关系的研究报道较少，且本试验主要是通过体外仿生试验测定的，因此仍需开展动物体内试验进一步验证。综上所述，基于体外方法模拟猪消化道的化学酶和微生物降解