激酶mTORC2在EAE模...CD4-+T细胞的调控作用_陈诚.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）是一种由免疫系统介导的慢性炎症性中枢神经系统脱髓鞘疾病，导致肌肉无力、步态困难、视觉障碍甚至瘫痪等症状，最终行为能力丧失，其主要病理特征表现为炎症浸润、脱髓鞘斑块以及轴突浸润1。有研究表明MS 的发病和疾病进程与 EB 病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染、吸烟、维生素D、以及遗传因素有关。中枢神经系统所产生的自身免疫性T细胞反应是MS的诱发因素，但MS的病因及发病机制迄今未明2-4。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE）是MS最常用且可靠的小鼠模型，其疾病特征在许多方面和MS相似5。EAE 模型是通过髓鞘衍生的抗原诱导形成 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0185-07；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230024激酶mTORC2在EAE模型中对致病性CD4+T细胞的调控作用陈诚，路金金，田钦，王怡飞*，叶丽林*摘要 目的 研究mTORC2信号缺陷减轻EAE临床症状和其对致病性CD4+T细胞的调控机制。方法 通过MOG35-55肽免疫分别诱导Rictorfl/flCD4cre（Rictor-/-）和Rictorfl/fl（WT）小鼠，记录其临床症状分数和体质量变化情况，应用流式细胞术检测致病性CD4+T细胞亚群的数目、过氧化脂质水平和线粒体来源的ROS水平。结果 Rictor-/-小鼠中EAE临床症状比WT小鼠更轻，致病性CD4+T细胞更少，且这群细胞更易发生铁死亡。结论 mTORC2信号缺陷通过促使致病性CD4+T细胞发生铁死亡来减轻EAE的临床症状。关键词 mTORC2；Rictor；CD4+T细胞；EAE中图分类号 R392.1文献标识码 AThe kinase complex mTORC2 regulates pathogenic CD4+T cells inEAE murine modelCHEN Cheng1,LU Jinjin2,TIAN Qin1,4,WANG Yifei2,3,*,YE Lilin1,*1.Department of Immunology,Basic Medical College,Army Medical University,Chongqing 400038,China;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Institute ofImmunological Innovation and Translation,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;4.Department of Science and Education,Dermatology Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510091,China*Corresponding Authors:WANG Yifei,E-mail:;YE Lilin,E-mail:Abstract This research is aimed to investigate the mechanism how mTORC2 deficiency alleviates clinicalsymptoms of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)and regulates pathogenic CD4+T cells.Rictorfl/flCD4cremice(Rictor-/-)and Rictorfl/fl(WT)mice were immunized with MOG35-55peptide to induce EAE,andthe clinical scores and body weight changes were recorded.Then,the pathogenic CD4+T cells were detected by flowcytometry to analyze the levels of lipid peroxidation and mitochondrial ROS generation.Compared with WT mice,Rictor-/-mice showed milder clinical symptoms of EAE and decreased pathogenic CD4+T cell population.Mechanistically,mTORC2 deficiency alleviates the clinical symptoms of EAE via inducing ferroptosis in pathogenicCD4+T cells.Key words mTORC2;Rictor;CD4+T cells;EAE基金项目：国家自然科学基金（31825011)作者单位：400038 重庆，陆军军医大学全军免疫学研究所（陈 诚，田 钦，叶丽林）；510515 广州，南方医科大学检验医学与生物技术学院（路金金，王怡飞）；400016，重庆医科大学免疫创新与转化研究院（王怡飞）；510091 广州，南方医科大学皮肤病医院科教科（田 钦）*通信作者：王怡飞，E-mail:；叶丽林，E-mail:185免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023的，EAE模型在研究MS的病因、发病机制以及治疗等方面不可或缺6。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）是一种表达于中枢神经系统的微量成分，MOG35-55是可以诱导中枢神经系统中产生强烈T细胞和B细胞反应的免疫优势表位，可以诱发MS的脱髓鞘特征，具有高度的免疫原性，是目前最常用的建立EAE模型的髓鞘抗原，用于诱导慢性EAE疾病模型，通常在建模后914 d开始诱发小鼠产生临床症状6-7。CD4+T细胞在适应性免疫应答中有着不可或缺的作用。在不同的抗原刺激的条件下，幼稚CD4+T细胞可分化为Th1、Th2、Th17和Treg等功能和特征各异的辅助性T细胞8。MS的发病机制主要由T细胞介导，T细胞在外周被中枢神经相关抗原激活，这些T细胞激活后穿过血脑屏障并进入中枢神经系统，使其产生病变并出现相应的临床症状，而CD4+T细胞在MS中的致病性已在EAE模型中得到证实9。之前的研究发现中枢神经系统自身免疫性疾病由产生 IFN-的 Th1 和产生 IL-17 的 Th17 等致病性CD4+T细胞亚群导致的，而大多数的研究表明致病性Th17是导致MS的罪魁祸首2,10。而在MS中，这群致病性CD4+T细胞具有长期存活的记忆细胞特征、对自身抗原产生有效反应并且可以介导自身免疫反应的反复发作11。在既往的研究中，我们发现激酶mTORC2信号对记忆性CD4+T细胞的维持起到重要的作用；这一发现推动我们探究此信号通路是否可调控自身免疫性疾病中的致病性CD4+T细胞的长期维持。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）是在进化上保守的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，密切调控 T 细胞的分化、功能和存活。mTOR 激酶由 mTORC1 和 mTORC2 两种复合体构成，它们有着相同的催化亚基mTOR，但是它们的支架亚基不同，Raptor 和 Rictor 缺失能够分别抑制mTORC1和mTORC2信号传导12-13。我们之前的研究发现敲除T细胞内Rictor基因会导致记忆性CD4+T 细胞发生铁死亡，mTORC2 通过 mTORC2p-AKTSer473p-GSK3Ser9这一信号通路来维持病毒特异性CD4+T细胞的长期存活14。基于此，我们认为，探究是否能够通过阻止mTORC2信号传导来引发自身反应性CD4+T细胞发生铁死亡来减轻EAE小鼠模型的临床症，具有一定的科学及临床意义。1材料与方法1.1实验材料MOG35-55短肽于中肽生化合成；弗氏完全佐剂、RPMI-1640培养基、PMA和Ionomycincalcium salt钙盐购自美国Sigma公司；百日咳毒素购自Enzo Life Sciences Inc公司；结核杆菌毒素购自List Labs公司；胎牛血清（FBS）、丙酮酸钠和非必需氨基酸（NEAA）购自Gibco公司；青-链霉素购自索莱宝公司；Percoll细胞分离液购自GE Healthcare公司；荧光标记抗小鼠抗体 FITC-IL-17A、PE(APC)-RORt、Percp(BV-510)-CD4、Percp(PE-cy7)-CD44、PB-IFN-和 PB-T-bet 等购自 Biolegend 公司；p-AKTSer473、p-S6 和 APC(FITC)-anti-Rabbit 购自 CellSignaling Technology 公司。胞内染色试剂盒、磷酸化染色试剂、BD Canto2流式分析仪、BD Fortessa流式分析仪和 BD Aria3 流式分选仪均为 BD 公司产品；FOXP3细胞核内染色试剂盒购自eBioscience公司。Rictorfl/fl、CD4cre基因小鼠和C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratory和斯贝福公司。Rictorfl/fl和CD4cre交配获得Rictorfl/flCD4cre（Rictor-/-，KO）小鼠。所有小鼠均饲养于温度为 25、湿度为 55%、12 h 光照/12 h黑暗的无特定病原体（SPF）动物房内，68周龄小鼠用于实验，且实验中所用小鼠雌雄均有。1.2EAE模型的诱导将MOG35-55肽用PBS溶解配制成2 mg/ml溶液，每只小鼠注射剂量为200 g，结核杆菌毒素用10 mg/ml的弗氏完全佐剂（CFA）溶液稀释成5 mg/ml，将稀释好的MOG35-55肽溶液和CFA溶液1 1混合后超声乳化，乳化液滴入水相后乳化物不散开即可用于后续实验，每只小鼠腹部皮下多点注射乳化液200 l，免疫后2 h和26 h 2次腹腔注射百日咳毒素500 ng（2次共1 g）。1.3EAE小鼠的体质量和临床症状评估在免疫的1周内，每2天观察并记录造模小鼠的体质量和临床症状，1周后每天记录。EAE模型小鼠临床症状评分：0分，无任何临床症状；0.5分，小鼠尾巴部分丧失紧张感，步态正常，一半的尾巴丧失紧张感，拿着小鼠时尾巴顶端不能弯曲；1分，尾巴瘫痪，步态正常，尾巴完全软弱无力气；2分，中等程度的后肢轻瘫，后肢无力，蹒跚行走；2.5分，严重的后肢无力，将小鼠倒置后很难翻转回去；3分，部分的后肢瘫痪，不能转向，拖动一只后肢；3.5分，后肢瘫痪，拖动2个186免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023后肢；4分，后肢瘫痪和部分的前肢瘫痪，前肢还有一些移动；4.5分，四肢瘫痪，不移动，垂死；5分，小鼠死亡15。1.4小鼠中枢神经系统T细胞获取麻醉诱导成功的EAE小鼠，PBS灌流冲洗出循环血液，取出小鼠的大脑和脊髓组织，于70 m的细胞滤网中研磨成细胞悬液，用R2（含2%FBS的1640-RPMI培养基）冲洗滤网，1 800 r/min离心6 min，用44%和66%的Percoll溶液2 100 r/min离心40 min进行细胞分层得到淋巴细胞。1.5体外诱导CD4+T细胞分化提前一晚