培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响_王肖.pdf

Vol.43 No.2Feb.2023第 43 卷 第 2 期2023 年 2 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2022-04-07基金项目：国家林业和草原局科技成果国家级推广项目（2020133123）；湖南省企业科技特派员计划项目（2021GK5006）；湖南省林业科技创新项目（XLKY202221）。第一作者：王肖（），硕士研究生。通信作者：曾艳玲（），教授，博士。引文格式：王肖,盘鑫海,刘馨蕴,等.培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导与再分化的影响 J.中南林业科技大学学报,2023,43(2):84-92.WANG X,PAN X H,LIU X Y,et al.Effects of medium and light quality on the callus induction and re-differentiation of Catalpa bungei petiolesJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2023,43(2):84-92.培养基与光质对楸树叶柄愈伤组织诱导 与再分化的影响王 肖1，盘鑫海1，刘馨蕴1，侯金波1，2，曾艳玲1（1.中南林业科技大学 a.经济林培育与保护教育部重点实验室；b.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2.安徽泓森高科林业股份有限公司，安徽 亳州 236814）摘 要：【目的】利用楸树间接器官发生途径培养愈伤组织并诱导出芽是楸树良种繁育的高效技术方法，同时也为楸树遗传转化方面的研究提供技术参考。【方法】以楸树试管苗叶柄为外植体，采用 L9（43）正交试验设计分别研究了不同基本培养基、植物生长调节剂浓度和光质等对愈伤组织诱导的影响，并对愈伤组织进行形态学和组织细胞学观察，据此筛选出适宜的诱导培养基，继而探索愈伤组织再分化的培养条件。【结果】在叶柄愈伤组织诱导过程中，基本培养基种类（MS、N6、DKW）的影响效应不显著，而 6-BA 浓度、NAA 浓度和光质对愈伤组织的诱导均具有显著影响。极差分析结果显示，当培养条件为白光，植物生长调节剂 6-BA 与 NAA的浓度比在 101 时最有利于愈伤组织的诱导，即楸树叶柄诱导愈伤组织的最佳培养基为 MS+1.0 mgL-1 6-BA+0.10 mgL-1 NAA，光质为白光；对 9 组愈伤组织制作石蜡切片，显微观察发现蓝光照射条件下，采用 DKW+3.0 mgL-1 6-BA+0.01 mgL-1 NAA 配方诱导出的愈伤组织细胞具有明显的拟分生组织，此愈伤组织在 DKW+0.2 mgL-1 TDZ+0.01 mgL-1 NAA 配方下可以成功诱导出不定芽。【结论】1）光照条件在愈伤组织诱导过程中具有显著的影响；2）TDZ 具有较高的活性，能够高效地促进楸树愈伤组织诱导不定芽生长。本研究初步建立了楸树叶柄愈伤组织诱导方法和不定芽诱导的有效培养条件，为楸树无菌苗培育及遗传转化体系建立提供技术支撑。关键词：楸树；叶柄；愈伤组织；光质；不定芽诱导中图分类号：S722.3+7 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2023)02-0084-09Effects of medium and light quality on the callus induction and re-differentiation of Catalpa bungei petiolesWANG Xiao1,PAN Xinhai1,LIU Xinyun1,HOU Jinbo1,2,ZENG Yanling1(1.a.The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry;b.The Key Lab of Non-wood Forest Products of Forestry State Forestry Administration,Central South University of Forestry&Technology,Changsha 410004,Hunan,China;2.Anhui Hongsen hi tech Forestry Co.,Ltd,Bozhou 236814,Anhui,China)Abstract:【Objective】The use of the indirect organogenesis pathway of Catalpa bungei C.A.Mey in the cultivation of callus and the induction of buds is an efficient technical method for the breeding of Catalpa bungei C.A.Mey,which provides a technical reference for the research on genetic transformation of Catalpa bungei C.A.Mey.【Method】The effects of different basic media,plant growth regulator concentrations and light quality on the induction of callus were investigated by using Catalpa bungei C.A.Mey seedling petioles as the explants in an L9(43)orthogonal test design,and the morphological and histocytological observation of the induced callus was carried out to screen for the suitable induction media and re-differentiation conditions for callus.【Result】The effect of the basic medium(MS,N6,DKW)was not significant,while the concentration of 6-BA,NAA and light quality had significant effects during the induction of petiole callus.The range analysis showed that when the cultivation conditions were white light and a concentration ratio of plant growth regulators of 6-BA to NAA as 101,it was conducive to the induction of callus.That is,the best medium for the induction of callus in Catalpa bungei C.A.Mey petioles was MS+1.0 mgL-1 6-BA+0.10 mgL-1 NAA,and the light condition was white light.Doi:10.14067/ki.1673-923x.2023.02.01085中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 43 卷楸树 Catalpa bungei C.A.Mey 是紫葳科梓属植物，具有耐寒冷、速生丰产、适应性强等优点，是一种园林观赏树种及优质木材资源树种，同时也具有珍贵的药用价值，其叶、树皮、种子均可作药用1-2。楸树在我国已具有几千年的栽培历史，自古以来就有“木王”的美称，受到人们的广泛喜爱3。然而，楸树自花不亲和，结实稀少，实生繁殖非常困难。传统的扦插、嫁接等方式又难以提高成活率且繁殖系数低，因此，开展楸树的组织培养研究，对缩短繁殖周期，提高繁殖系数具有重要的现实意义。通过对植物器官离体培养，经过脱分化与再分化建立植物离体再生体系是实现对珍贵种质快速扩繁、保存和利用的生物技术育种手段之一，同时也是进行遗传转化研究的重要途径之一。目前，许多研究普遍关注到不同基本培养基和植物生长调节剂种类对愈伤组织诱导及分化的影响4-5，然而仅有少量研究关注到光质条件作用于外植体培养过程中也会对愈伤组织的诱导和分化产生显著性影响。如郭君丽等6在山药零余子愈伤组织诱导中发现，红光和黄光有利于愈伤组织生长率的提高；陈博7在喜树愈伤组织形成与分化研究中发现，蓝光对愈伤组织的诱导具有显著的影响。近年来，楸树组织培养植株再生已得到较为广泛的关注，大部分研究围绕带芽茎段展开，已成功建立起快繁体系8-9。而在愈伤组织诱导方面的研究较少，仅有杨燕等10以楸树无菌苗各器官为外植体探讨不同基本培养基、6-BA 和 NAA 对愈伤组织诱导的影响；Lin 等11研究了 6-BA 和 NAA不同浓度配比下愈伤组织的诱导情况。有关综合讨论基本培养基、植物生长调节剂以及培养光质条件对楸树叶柄诱导愈伤组织的影响的研究尚未见报道。本研究以楸树无菌苗幼嫩叶柄为外植体，研究基本培养基、植物生长调节剂和光质条件对楸树愈伤组织诱导及分化的影响，以期为种苗繁育及基因功能研究提供技术参考。1 材料与方法1.1 材 料楸树种子来源于安徽泓森高科林业股份有限公司。本研究以楸树种胚组织培养获得的无菌苗为试验材料，取楸树无菌苗幼嫩的叶柄作为诱导愈伤组织的外植体。1.2 试验方法1.2.1 楸树无菌苗及种胚愈伤组织的获取将 10 月份采摘于母树上的楸树种子带回实验室，进行如下消毒处理：自来水浸泡 48 h，流水冲洗 3 h，超净工作台上 75%酒精消毒 30 s，无菌水冲洗 4 次，然后用 0.1%升汞浸泡 4 min，期间不断摇晃，无菌水冲洗 5 6 次。消毒后的种子放到滤纸上待用，接种时剥去种子外种皮，接种到 MS 培养基中，待其长出楸树无菌苗用作叶柄愈伤组织诱导的材料。经过叶柄愈伤组织诱导培养条件筛选后，取消毒后的种胚接种至最佳培养条件下诱导愈伤组织，用作后续再分化研究的验证材料。1.2.2 楸树叶柄愈伤组织的诱导1）外植体接种培养基组合以培养基、植物生长调节剂（6-BA，NAA）和光质作为研究影响因素，设计 4 因素 3 水平正交试验 L9（43）（表 1），共 9 种组合（A1 A9），另培养基中附加 30 gL-1蔗糖，6.5 gL-1琼脂，pH值调节为 5.8 5.9，将培养基在 121高温高压下灭菌 15 min。2）外植体的接种待楸树无菌苗长到 5 6 cm 高时，取无菌苗的叶柄作为外植体，切成 0.6 0.8 cm 的小段，接种到 A1 A9 组培养基中，每组接种 10 12个外植体，重复 3 次，置于各光质(LED 光源）下培养，培养温度为（255），光照时间 16 h/d，光照强度为（505）molm-2s-1，30 d 后统计各组愈伤组织诱导率。The paraffin sections were prepared for 9 groups of callus,and the microscopic observation revealed that the callus cells induced by the formulation of DKW+3.0 mgL-1 6-BA+0.01 mgL-1 NAA under the blue light had obvious meristemoids,and this cal