枇杷抑制α-葡萄糖苷酶和α...活性部位的筛选及其酶动力学_魏爱红.pdf

研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)53DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 031927引用格式:魏爱红，李晓虹，曾煌，等 枇杷抑制-葡萄糖苷酶和-淀粉酶活性部位的筛选及其酶动力学J 食品与发酵工业，2023，49(5):53 59 WEI Aihong，LI Xiaohong，ZENG Huang，et al Screening of effective fraction from Eriobotrya japonica(Thunb)Lindl with inhibiting activity against-glucosidase and-amylase and its inhibition kinetics J Food and Fermen-tation Industries，2023，49(5):53 59枇杷抑制-葡萄糖苷酶和-淀粉酶活性部位的筛选及其酶动力学魏爱红1，李晓虹2，曾煌1，2，梁淑荷2，林展雯3，庄远杯1，2，张声源1，2*1(广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室(嘉应学院)，广东 梅州，514015)2(嘉应学院 医学院客家药用生物资源研究所，广东 梅州，514031)3(嘉应学院 医学院分子生物学中心实验室，广东 梅州，514031)摘要比较研究枇杷不同药用部位(根、茎、叶、花、果肉、种子)醇提取物对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制活性，并探究最强活性部位及其总黄酮的酶促反应动力学特征。采用 95%乙醇超声提取制备枇杷不同药用部位醇提取物，超声辅助浸提并经 AB-8 大孔树脂制备总黄酮，利用紫外光谱法测定-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制活性，通过酶促动力学方法与 Lineweaver-Burk 曲线推断酶抑制类型。结果表明，枇杷不同药用部位醇提取物均具有一定的-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制活性，-葡萄糖苷酶抑制活性强弱依次为花 茎 根 叶 果肉 种子，-淀粉酶抑制活性强弱依次为根 茎 花 叶 果肉 种子。枇杷花醇提取物、枇杷花总黄酮对-葡萄糖苷酶抑制活性半抑制浓度(half inhibitory concentration，IC50)值分别为(4 65 0 35)、(0 017 4 0 003 5)g/L，均为可逆非竞争性抑制类型;对-淀粉酶抑制活性 IC50值分别为(14 41 0 59)、(1 57 0 03)g/L，均为可逆非竞争性抑制类型。枇杷根对-淀粉酶抑制活性最强，IC50值为(1 51 0 24)g/L，为可逆竞争性抑制类型。该研究结果为枇杷作为降血糖食品药品的开发利用提供了科学依据。关键词枇杷;-葡萄糖苷酶;-淀粉酶;酶促动力学;Lineweaver-Burk 曲线第一作者:学士，助理实验师(张声源副教授为通信作者，E-mail:mcdullzhang yeah net)基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(81703662);嘉应学院科研项目(2021KJY06);梅州市医药卫生科研课题(2021-B-63);梅州市应用型科技专项资金项目(2020B0205004，2021B0201001);广东省大学生创新创业项目(202110582008，202010582269)收稿日期:2022-04-11，改回日期:2022-05-06据国际糖尿病联盟(International Diabetes Feder-ation，IDF)第 10 版数据显示，2021 年全球 20 79 岁的成年糖尿病患者达 5 37 亿，预计到 2030 年将增至6 43 亿，到 2045 年将增至 7 83 亿，中国糖尿病患者居世界首位1。持续性高血糖常导致糖尿病心脑血管病变、糖尿病神经病变、糖尿病肾病等并发症，严重危害人体健康2。-葡萄糖苷酶、-淀粉酶是降低餐后血糖的重要靶点，作用于该靶点的阿卡波糖等临床运用制剂在中国糖尿病药物市场占据主导地位，仅次于胰岛素类3。但阿卡波糖对-淀粉酶的过度抑制是其副作用产生的因素之一4。中草药具有多成分、多靶点协调作用的特点，在治疗消渴疾病的运用历史悠久，是现代降血糖先导化合物挖掘的重要来源，从中药材中挖掘更为安全、低毒、有效的天然-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制剂在降血糖食品药品的开发具有重要的意义。枇杷Eriobotrya japonica(Thunb)Lindl为蔷薇科枇杷属常绿小乔木，食用药用历史悠久，枇杷叶已收录于 中国药典，枇杷花在 2019 年被批准为新食品原料，而果肉则作为水果食用，表明枇杷资源具有良好的药用食用基础，作为大健康食品药品的开发，具有更高的安全性5。枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子均可供药用，具有降逆和胃、化痰止咳、止泻功效，主治肺热咳喘、呕吐、烦渴等症状6，现已有枇杷叶膏、枇杷止咳颗粒等多种制剂应用于临床7。现代药理研究显示，枇杷主要含三萜、黄酮、酚类等化学成分，具有镇咳祛痰、降血糖、抗氧化、降血脂、抗菌消炎等药理作用8 12。枇杷降血糖药理活性显著，作为降血糖药用资源的开发具有广泛前景。关于枇杷降血糖的研究主要集中于枇杷叶和枇杷花，枇杷不同药物部位(根、茎、种子、叶、果肉、花)对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制活性差异的研究未见报道。本文以枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子的 95%乙醇提取物为研究对象，测定枇杷不同药用部位对-葡食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES542023 Vol.49 No.5(Total 473)萄糖苷酶、-淀粉酶抑制能力，明确活性部位，并进一步探究活性部位醇提取物及其主要组分总黄酮的酶促反应特征，为枇杷资源在降血糖功能食品药品的开发和高效利用提供科学依据。1材料与方法1 1材料与试剂枇杷于 2020 年 7 月采自广东省梅州市梅江区，经嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所张声源副教授鉴定为蔷薇科(osaceae)枇杷属(Eriobotrya)枇杷Eriobotrya japonica(Thunb)Lindl 。对硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)、对-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-D-galactopyranoside，pNPG)，上海源叶生物科技有限公司;-葡萄糖苷酶、-淀粉酶、牛血清白蛋白，Sigma 有限公司;阿卡波糖，德国拜耳有限公司;可溶性淀粉，天津市大茂化学试剂厂;NaOH，上海麦克林生化科技有限公司;KH2PO4、K2HPO4，阿拉丁有限公司。1 2仪器和设备SPAK 酶标仪，TECAN 公司;FA2004 电子分析天平，德国赛多利斯有限公司;N-1100V 旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;MING-CHE 24UV 超纯水机，法国 Merck Millipore 公司;PB-21 型 pH 计，北京赛多利斯科学仪器有限公司;DHP-9052 电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。1 3样品的制备枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子，晒干，粉碎，按料液比 1 3(g mL)加入 95%乙醇超声波提取 3 次(30 min、35、100 Hz、200 W)，静置 24 h，用 8 层纱布过滤，合并提取液，浓缩得到枇杷根醇提物(提取率 10 09%)、枇杷茎醇提物(提取率 4 64%)、枇杷叶醇提物(提取率 7.34%)、枇杷花醇提物(提取率6.21%)、枇杷果肉醇提物(提取率 43.90%)、枇杷种子醇提物(提取率 7.93%)，保存备用13。枇杷花总黄酮的提取及纯化:称取枇杷花粉末200 g，依照 1 20(g mL)的料液比，加入体积分数为60%的乙醇，超声波辅助浸提 3 次(250 W、60、40 min)，抽滤，合并滤液，4、4 000 r/min 离心5 min，取上清液，浓缩干燥得枇杷花黄酮粗提物32.04 g，提取率 16 02%，总黄酮含量以芦丁当量，即1 g 干样品中黄酮类化合物相当于芦丁的质量(mg)，以 rutin mg/g 表示，含量为(4446 134)rutin mg/g。准确配制 6 g/L 的枇杷花黄酮粗提物溶液，加至AB-8 大孔树脂层析柱，4 h 的静置吸附时间，先用蒸馏水洗去杂质，洗脱到滴出液无色，再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱，洗脱速率为 2 BV/h，洗脱体积为 3 BV，收集洗脱片段，减压浓缩干燥得精制枇杷花总黄酮，含量为(73 95 1 96)rutin mg/g14 15。1 4-葡萄糖苷酶的抑制活性采用微孔板法测定16，在 96 孔微孔板上加入110 L PBS(pH 6 8，67 mmol/L)，10 L 样品溶液，20 L 0 1 U/mL-葡萄糖苷酶，振荡混匀，37 恒温孵育15 min，加入20 L 40 mmol/L pNPG，混匀，37 恒温反应 15 min，于405 nm 测吸光度，平行3 次。以阿卡波糖为阳性对照，按照公式(1)计算抑制率。抑制率/%=(Ac Ab)(As Ad)Ac Ab100(1)式中:Ac，PBS 代替样品的反应体系吸光度;Ab，PBS代替样品和酶的反应体系吸光度;AS，样品组的反应体系吸光度;Ad，PBS 代替酶的反应体系吸光度。1 5-淀粉酶的抑制活性采用微孔板法测定17，依次加入样品 溶 液120 L，120 L 10 U/mL-淀粉酶溶液，振荡混匀，加入 120 L 已于 37 预温 5 min 的 10 g/L 可溶性淀粉溶液，混匀，37 反应 15 min，立即加入 200 LDNS 显色，沸水浴 5 min，冰水冷浴 5 min，加入1 040 L PBS 至1 600 L，于540 nm 测定吸光度，平行 3 次。以阿卡波糖为阳性对照，按照公式(1)计算抑制率。1 6对-葡萄糖苷酶抑制动力学试验参考文献 18 19，在 pNPG 浓度为 4 0 mmol/L，在 3 组质量浓度下(枇杷花醇提取物为 0、5、10 g/L;枇杷花总黄酮为 0、0 026 1、0 052 2 g/mL)，分别测定不同-葡萄糖苷酶活力时的酶促反应初速度，以酶活力(U/mL)为横坐标，反应初速度 V0mol/(Lmin)为纵坐标作图，判断可逆或不可逆抑制类型。固定-葡萄糖苷酶活力为 0 1 U/mL，在 3 组质量浓度下(枇杷花醇提取物为 0、5、10 g/L;枇杷花总黄酮为 0、0 026 1、0 052 2 g/mL)，测定不同 pNPG浓度反应体系的反应速率，横坐标为 pNPG 浓度的倒数(1/S)，纵坐标为反应初速度的倒数(1/V0)绘制Lineweaver-Burk 曲线，判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制抑或反竞争性抑制类型。1 7对-淀粉酶抑制动力学试验参考文献 20 的方法，在 10 g/L 可溶性淀粉溶研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)55液，在 3 组质量浓度下(枇杷根为 0、1 5、3 g/L;枇杷花总黄酮为 0、0 78、1 57 g/L)，分别测定不同-淀粉酶活力反应体系下的反应初速率，以酶活力为横坐标、反应初速率 mol/(Lmin)为纵坐标作图，判断其可逆或不可逆抑制类型。固定-淀粉酶活力10 U/mL，在3 组质量浓度下(枇杷根为 0、1 5、3 g/L;枇杷花总黄酮为 0、0.78、1.57 g/L)，测定其在不同淀粉质量浓度(0.312、0.625、1.25、2.5、5、10 g/L)反应体系下的反应初速率，以底物质量浓度的倒数(1/S)为横坐标、反应初速率的倒数(1/V0)为纵坐标绘制 Lineweaver-Burk曲线，判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制抑或反竞争性抑制类型。1 8统计学处理方法实验重复 3 次，通过 Origin 8 5 软件进行数据处理并作图，结果以平均值 标准差表示。2结果与分析2 1-葡萄糖苷酶抑制活性由图 1 可知，枇杷不同药用部位醇提取物均具有-葡萄糖苷酶抑制活性，在一定质量浓度范围内，抑制率随质量浓度的增大而增强，呈现一定的量效关系。图 1样品对-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig 1The-glucosidase in