沤竹过程中细菌菌群的结构变化和作用_李宇.pdf

第 44 卷 第 3 期2023 年 3 月纺 织 学 报Journal of Textile ResearchVol.44,No.3Mar.,2023DOI:10.13475/j.fzxb.20211202308沤竹过程中细菌菌群的结构变化和作用李 宇1,2,傅佳佳1,2,CAVACO-PAULO Artur1,2,王鸿博1,2,高卫东1,2(1.江南大学 江苏省功能纺织品工程技术研究中心,江苏 无锡 214122;2.江南大学 生态纺织教育部重点实验室,江苏 无锡 214122)摘 要 为缩短竹材生物脱胶时间,得到能够满足后道加工的工艺纤维(竹束),并提高成品质量,探索了温水沤竹过程中细菌菌群结构的演替规律及作用机制。采用高通量测序与传统可培养技术相结合的方法,确定了沤竹过程中的优势菌;并结合水沤过程中竹块的形态变化以及竹块与竹束的化学成分差异,分析了菌群在水沤脱胶过程中的作用。结果表明:竹材的水沤脱胶过程以木质素的降解为主,以竹粉为唯一碳源筛选得到的 5 株菌株,在属水平上仅占总菌群的0.70%3.21%,优势可培养菌种为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。筛选获得的可培养菌种中缺少起发酵作用使竹块膨胀的菌种,因此,预处理-优势菌种复配的联合工艺可以作为一种提高竹脱胶效率的手段。关键词 沤竹;木质素降解;细菌菌群;高通量测序;黏质沙雷氏菌;枯草芽胞杆菌中图分类号:TS 121.8 文献标志码:A 收稿日期:2021-12-13 修回日期:2022-12-21基金项目:国家自然科学基金面上项目(31470509);中国博士后科学基金资助项目(2019T120390);江苏省政策引导类计划项目(BZ2020010)第一作者:李宇(1993),女,博士生。主要研究方向为功能化纺织品。通信作者:傅佳佳(1983),女,教授,博士。研究方向为纤维制品绿色加工技术及清洁化生产。E-mail:。我国是世界竹类植物的起源地和分布中心之一1-2,竹类资源丰富,竹子种类、竹林面积和蓄积量均居世界之首。竹子生长速度快、产量高、易种植、可生物降解,是一种理想的环保型天然纤维素纤维。同时,竹纤维具有优异的吸湿放湿性能,天然的抗菌、抗紫外线功能以及良好的服用舒适性3。在纺织领域开发利用竹类资源,既是对我国丰富资源的合理利用,也为纺织业绿色纤维的开发寻求到一个新的突破口,具有重要的经济效益和社会效益。竹纤维分为竹原纤维和竹浆纤维 2 大类。现阶段竹浆纤维在纺织上的应用已日趋成熟4-6,而获取竹原纤维的技术还有待发展。竹原纤维的制备大多采用化学-机械法7-9,具体流程为:整料清洗浸泡蒸煮开松分梳。在浸泡过程中常使用一定浓度的碱液9-10,导致竹纤维丧失了原本的抗菌性11。而在后续的机械挤压、梳理过程中,竹纤维易被梳断7。已有研究表明,选用 2 a 生毛竹制得的竹原纤维平均长度为 20 mm,平均直径为0.07 mm,但纤维长度整齐度较差,且细度不匀率较大8。不同竹种、不同竹龄、不同部位的竹材制得的竹原纤维线密度也有一定程度的差异12。上述问题增加了竹原纤维纺纱工艺的设计难度,也限制了竹原纤维的发展与应用。近年来,生物脱胶法因其脱胶程度可控,且能够在较大程度上保护竹纤维的特性,降低脱胶加工费用,减少脱胶废水对环境的污染,提升产品附加值等优点,逐渐成为人们关注的热点。生物技术能否成功地制取竹原纤维,取决于选用的菌株(生物酶)是否能与竹材的结构、组分特性等有机结合。发展生物脱胶技术,关键是要获得适合特定植物原料脱胶体系的微生物复合群体,而这种特定菌群的信息往往可以基于自然界中的现象探寻。天然水沤工艺依靠环境中的微生物可有效地去除麻杆中的非纤维素物质13,同时避免了化学试剂对麻纤维的强力损伤。而温水沤麻法制取的麻纤维质量更高,废水对环境污染更小14。竹和麻的主要化学成分相同,以木质素、半纤维素和纤维素为主,因此竹原纤维的制备可借鉴温水沤麻工艺。本文将竹材置于可控的反应条件下进行脱胶,采用高通量测序和传统可培养技术相结合的方式,分析水沤脱胶过程中细菌菌群的多样性和动态变化规律,并筛选竹脱胶的优势可培养菌株,以期为竹脱胶菌种的选育以及高品质竹纤维的生产提供参考。第 3 期李 宇 等:沤竹过程中细菌菌群的结构变化和作用 1 实验部分 1.1 实验材料 3 个月生毛竹,采自江苏省无锡市惠山地区。部分毛竹粉碎后过孔径 0.15 mm 筛,用于配制竹粉培养基。溶菌肉汤(LB)液体培养基:胰蛋白胨 10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,酵母提取物 5.0 g/L,pH 值 7.07.2。LB 固体培养基:向 LB 液体培养基加入1520 g/L 琼脂粉。竹粉单碳源培养基:竹粉 5.0 g/L,KNO3 0.5 g/L,(NH4)2SO4 0.5 g/L,NaCl 0.2 g/L,自然 pH值。上述培养基于 115 灭菌 20 min。E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 试剂盒、Quibit3.0 DNA 检测试剂盒、16 S rDNA 基因 V3-V4区带有 barcode 的引物,均由生工生物工程(上海)有限公司提供。其余试剂为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。1.2 实验仪器 Y172 型纤维切片器(上海精密仪器仪表有限公司),生物显微镜(上海精密仪器仪表有限公司),DYCA-21 电泳槽(北京市六一仪器厂),T100 Thermal Cyeler 型 PCR 仪(美国 BIO-RAD 生命医学产品有限公司),QWZY-X3 型三层振荡培养箱(太仓市强文实验设备有限公司),Synergy H1 型多功能微孔检测仪(美国 Biotech 公司)。1.3 实验方法1.3.1 沤竹体系构建 将毛竹劈成 57 cm 的竹块,在自来水下冲洗干净。沥干的竹块在室温条件下平衡24 h。称取约10 g 的竹块,放入装有去离子水的三角烧瓶中,浴比为 1:10。沤制温度为 37,湿度为 65%。竹块脱胶程度的判定采用改良的 Fried 实验法:将沤制的竹块放入试管中,加入沸水淹没竹块;试管在高速振荡器上涡旋 10 s,再垂直摇晃 4 次;根据束纤维从竹块中分离的程度记为不分散、部分分散、基本分散和完全分散。1.3.2 竹束纤维表面形貌表征及化学成分含量测试 选取纤维分离程度为完全分散的竹束纤维,手扯至平行伸直状态置于载玻片上,在显微镜下观察其纵向形态。将整理好的竹束纤维嵌入 Y172 型哈氏切片器的凹槽中,用火棉胶固定,然后切出 10 30 m 的薄片,用于观察竹束横截面的形态。参照 GB/T 58891986苎麻化学成分分析方法测定竹块(未经水沤)和竹束纤维中主要化学成分含量。1.3.3 细菌基因组脱氧核糖核酸(DNA)的提取 分别于第 3 天、第 6 天、第 12 天、第 18 天、第21 天和第 24 天对沤液进行取样,依次命名为 D03、D06、D12、D18、D21、D24。室温条件下取 2 mL 沤液,在 10 000 r/min 转速下离心 3 min,收集各样品的沉淀物。采用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 提取各样品沉淀物的基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的完整性。1.3.4 聚合酶链反应(PCR 扩增)及高通量测序 选取 V3-V4 通用引物,对上述得到的基因组DNA 进行 PCR 扩 增。引 物 序 列 分 别 为:314F:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCT-ACGGGNGGCWGCAG 和 805R:GACTGGAGTTCCT-TGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCT-AATCC。第 1 轮 PCR 扩增程序为:94 预变性3 min;94、30 s,45、20 s,65、30 s,5 个循环;94、20 s,55、20 s,72、30 s,20 个循环;72 延伸 5 min。第 2 轮 PCR 扩增,引入 Illumina桥式 PCR 兼容引物。扩增程序为:95 预变性3 min;94、20 s,55、20 s,75、30 s,5 个循环;72 延伸 5 min。扩增产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳检测和 Qubit3.0 DNA 检测试剂盒精确定量,然后在 Illumina Miseq 测序平台进行高通量测序(生工生物工程(上海)有限公司)。1.3.5 数据分析 高通量测序(Miseq 平台)结果处理:首先,去除引物接头序列;其次,根据双端测序数据(PE reads)之间的重叠关系,将成对的序列拼接成 1 条序列;最后,按照标签序列(barcode)识别并区分样品得到各样本数据。操作分类单元(OTU)聚类:所有样本序列按照序列间的距离进行聚类,将相似水平大于或等于97%的序列归并为 1 个操作分类单元。生境内(alpha)多样性分析:根据聚类分析结果计算香浓指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、ACE 指数和 Chao1 指数,来衡量样品的 alpha 多样性。物种(菌门或菌属)分类分析:将样本序列进行物种分类,对每个样本和每个物种单元进行序列丰度计算,绘制物种丰度图。1.3.6 可培养菌株的筛选 对不同沤制时间的沤竹体系进行可培养细菌筛选。首先,使用 LB 液体培养基对沤液(1 mL)进行富集培养。其次,将富集培养液稀释到合适的倍数,并在 LB 固体培养基上进行涂布,制得的平板放入79 纺织学报第 44 卷37 培养箱倒置培养 12 d。培养过程中观察并挑取平板中合适的单菌落转移至 LB 液体培养基中扩大培养 24 h。然后,将含有单菌落的菌液转移到竹粉单碳源培养基中进行筛选培养。富集培养、扩大培养和筛选培养均在摇床中进行,温度为 37,转速为 50 r/min。筛选培养过程中定期取样,测量菌液在 600 nm 处的 OD 值,当菌液的 OD 值明显高于空白单碳源竹粉培养基时,即可认为该菌能够以竹粉为单一碳源生长。利用 16 S rDNA 两端的引物PCR 扩增筛选菌株的 16 S rRNA 基因,并进行 DNA 测序。与 GenBank 中的已知序列进行同源性比对,判定细菌的种类。2 结果与讨论2.1 竹束纤维表面形貌分析观 察 沤 制 过 程 中 竹 块 的 形 态 变 化,依 据1.3.1 节中提及的 Fired 法判定:竹样在沤制前 6 天未分散,在第 12 天部分分散,在第 21 天基本分散,在第 24 天完全分散,表明竹块脱胶完成。根据竹样的分散情况,将水沤过程划分为 3 个阶段:第 0 12 天为沤竹前期,第 1218 天为沤竹中期,第 1824 天为沤竹后期。取不同沤竹阶段的沤液,用以后序的高通量测序和可培养菌株筛选。竹块(未经水沤)和竹束中纤维素、半纤维素、果胶和木质素的含量如表 1 所示。结果表明,水沤前后竹样的主要化学成分没有发生改变。与未经水沤的竹块相比,所得竹束(水沤第 24 天)的纤维素质量分数上升至(48.610.64)%,说明水沤工艺有效地分解了竹块中的非纤维素物质。竹样中木质素的含量由沤制前的(18.320.19)%下降至(14.310.85)%,表明木质素的降解在非纤维素物质的去除过程中占主要地位,而半纤维素和果胶在竹束中的含量较竹块略有上升,这是因为随着木质素的降解,竹样结构松散,处于内部的半纤维素和果胶成分更容易被检测。水沤前后,竹样中主要化学成分含量的变化趋势与文献7的结论相吻合。表 1 竹块和竹束中主要化学成分的含量Tab.1 Contents of different chemical components in raw bamboo and bamboo fiber bundles竹样纤维素/%半纤维素/%果胶/%木质素/%竹块(未经水沤)42.050.6132.941.2618.320.19竹