尿素中毒对山羊肾脏氧化应激及铁死亡指标的影响_郝宁浩.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（）；四川省肉羊创新团队防疫岗位基金项目（）；四川省科技厅项目（）作者简介：郝宁浩，硕士研究生。通信作者：王利，教授，主要从事动物病理学研究，：；魏勇，研究员，主要从事动物疾病防控研究，：。郝宁浩，张桦，王利，等 尿素中毒对山羊肾脏氧化应激及铁死亡指标的影响 南京农业大学学报，（）：，（）：尿素中毒对山羊肾脏氧化应激及铁死亡指标的影响郝宁浩，张桦，王利，魏勇，向益，俄木曲者，孟元华，苗斌，陈勇（西南民族大学动物科学国家民委重点实验室，四川 成都；四川省畜牧科学研究院，四川 成都；四川省凉山州农业科教中心，四川 西昌；四川省巴中市南江黄羊科学研究所，四川 南江）摘要：目目的的 本研究旨在探究尿素引起山羊肾脏损伤的病理分子机制。方方法法 选择健康无病的简州大耳羊 只，将试验羊随机分为 组：对照组（组）、尿素组（组）和 尿素组（组），日粮供给采用粗精料混合饲喂及尿素代替部分豆粕的精料饲喂方式，对照组不加尿素，试验周期为 。试验结束后，检测血清血氨含量、肾组织氧化应激指标和铁离子含量，用 染色和 染色观察肾组织病理损伤，透射电镜观察肾小管上皮细胞的超微结构，检测肾组织铁死亡相关基因 相对转录水平，检测谷胱甘肽过氧化物酶（）蛋白表达水平。结结果果 与对照组相比，组和 组简州大耳羊丙二醛（）含量极显著上升（），谷胱甘肽（）含量和超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽过氧化物酶（）活性极显著下降（），铁离子含量极显著上升（），肾小管上皮细胞肿胀、变性、坏死，胶原纤维增生，肾小管上皮细胞线粒体皱缩，膜电子密度增加，膜嵴减少，铁蛋白重链 基因（）、电压依赖性阴离子通道 基因（）、肿瘤抑制基因、核受体辅活化子（）基因 表达水平均极显著上升（），水平和蛋白表达水平均显著下降（）。结结论论 添加高剂量尿素导致山羊尿素中毒，表达受到抑制并启动细胞铁死亡机制，引起肾脏氧化应激和铁离子代谢失衡。关键词：简州大耳羊；尿素；肾脏；铁死亡；组织病理学中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，；，；，）：，（），（）（），（），（）（），（），（）第 期郝宁浩，等：尿素中毒对山羊肾脏氧化应激及铁死亡指标的影响（）（），（），（，），（），（）（）（）（），：；尿素是一种极易溶的结晶含氮化合物，常作为反刍动物饲料添加剂以补充氮素，其氮含量高达，属于非蛋白氮（）。饲喂过量，尿素在脲酶的作用下可生成大量氨，进入血液循环，引起高血氨症，进而引起尿素中毒。也有牛和羊意外饮用尿素引发尿素中毒案例报道。肾脏作为动物机体最重要的水代谢器官之一，其肩负着防止外界毒物入侵和排除代谢废物的双重作用，能够过滤血液并通过尿液排泄代谢废物，同时控制血液电解质和酸碱平衡。重金属和药物都均可引起肾脏损伤，氟中毒可引起小鼠肾脏氧化损伤，汞中毒可通过减弱内皮细胞的趋化运动及迁移、黏附能力增加滤过膜的通透性而引起肾脏损伤，啶虫脒可引起肾脏药物性损伤。目前，未见尿素引起肾脏损伤及其机制的相关报道。铁死亡（）为近年来发现的一种新的非凋亡细胞死亡模式，是一种铁离子依赖性、过氧化反应驱动、以细胞内活性氧（，）堆积为特征的氧化性细胞死亡，其形态特征、生化特性、遗传因素等均明显区别于细胞凋亡、焦亡、坏死、自噬等不同的细胞死亡方式。黄紫霞等研究表明过氧化氢通过增加氧化应激水平诱发铁死亡导致人脐静脉内皮细胞损伤。张新等报道饲喂高脂饲料使小鼠肝脏氧化应激水平升高而诱发铁死亡而导致小鼠肝脏损伤。本试验通过在日粮中添加不同水平尿素，观察氧化应激相关指标、组织病理学和铁死亡相关基因 转录水平的变化，揭示尿素引起简州大耳羊肾脏损伤的病理分子机制，旨在为探究尿素引起山羊中毒的机制提供参考资料。材料与方法 试验设计试验于 年 月在四川省某种羊场进行。选择 月龄、体重 、健康的简州大耳山羊 只，随机分成 组，对照组（组）、尿素组（组）、尿素组（组）。试验前对所有羊进行驱虫处理，日粮供给方式采用粗精料混合饲喂并采用尿素代替部分豆粕的精料饲喂方式，对照组不加尿素。其各组精料成分配方详见表。每日 次（：、：、：）进行等量饲喂，每只羊每次投喂等量饲料。自由采食和饮水，预饲期 ，正式试验 。试验结束后，颈动脉放血致死，采集肾脏样品，分别储存于液氮罐和（体积分数）多聚甲醛磷酸缓冲液以及（体积分数）的戊二醛溶液中。试验试剂兔抗 抗体（），一抗购于北京博奥森生物技术有限公司；发光试剂盒、辣根过氧化物酶（）标记的山羊抗兔、试剂盒购于北京中杉金桥生物有限公司；丙二醛（）含量和谷胱甘肽（）含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（）、总超氧化物歧化酶（）活性检测试剂盒均购自南京建成科技有限公司；染色试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；铁离子检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。血清血氨检测试验结束后对各组羊颈静脉无菌采血，于 离心 ，收集血清，用血氨测定试剂盒测定各组羊血清中血氨的含量。氧化应激指标检测对各组羊的肾脏用无菌剪剪碎，与生理盐水按体积比 混匀，用超声波破碎仪破碎，按照试剂盒说明书操作，测定氧化应激指标、含量和、活性。铁离子含量检测取各组羊肾脏 于 管中，加入 倍体积生理盐水，用超声波破碎仪在 条件下破碎，每南 京 农 业 大 学 学 报第 卷次 ，间隔 反复 次，制成组织匀浆，离心后取上清液备用。按照试剂盒说明书检测肾脏铁离子含量。表 日粮的精料组成及营养组成水平 组成对照组（）尿素组（）尿素组（）精料原料组成 玉米 豆粕 麸皮 碳酸氢钠 食盐 预混料 尿素 合计 粗料（苜蓿）营养组成 干物质 粗灰分 粗蛋白 粗脂肪 ；粗纤维 中性洗涤纤维 酸性洗涤纤维 钙 磷 总能 注：总能单位为 。组织病理切片制作及 染色采集各组羊肾脏样品经生理盐水冲洗后用 多聚甲醛固定 ，用不同浓度梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明处理按照常规方法进行浸蜡包埋和切片处理。水浴锅提前预热，用附有蛋白甘油的载玻片捞片，插入染色架后于 烘箱中干燥，脱蜡，复水后常规苏木素伊红（）染色，中性树胶封片，用光学显微镜观察其病理变化。各组羊肾脏组织切片脱蜡、复水，铁苏木素染色 ，蓝化液返蓝 ，丽春红品红染色，磷钼酸洗 ，最后苯胺蓝染色 ，逐级乙醇脱水 ，二甲苯透明 ，中性树胶封片，用光学显微镜观察结果。透射电镜切片制作与染色将保存于 戊二醛的各组羊肾脏样品取出，用 锇酸固定 ，在 条件下用不同浓度乙醇逐级脱水 。室温包埋与切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，用透射电子显微镜观察肾上皮细胞结构变化。荧光定量 检测铁死亡基因的表达用试剂盒提取各组山羊肾组织，反转录成。用 软件设计铁死亡相关基因的特异性引物并交上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以各组 为模板，进行荧光实时定量（），以山羊的 基因作为内参对照。扩增体系（）：，正、反向引物（表）各 ，模板 ，。反应程序：，个循环；以 从 升至 。采用 分析各组肾脏的铁死亡相关基因表达。检测 蛋白的表达根据蛋白提取试剂盒提取肾组织总蛋白后进行，将电泳胶置于 电泳缓冲液中平衡，以 恒压 将蛋白转印 膜，用 的脱脂奶粉于 恒温摇床封闭 。封闭后加入 稀释的兔抗 单克隆抗体（一抗），孵育过夜，再加入 稀释的 标记的山羊抗兔（二抗）后室温孵育 ，用 发光试剂进行显色 ，用智能凝胶化学发光成像系统进行分析。第 期郝宁浩，等：尿素中毒对山羊肾脏氧化应激及铁死亡指标的影响表 铁死亡相关基因表达的引物对序列 目的基因 引物对序列 （）产物长度 登录号 ：注：电压依赖性阴离子通道 ；：电压依赖性阴离子通道 ；：铁蛋白重链，；：核因子 相关因子 ；：铁蛋白轻链 ；：核受体辅活化子 ；：肿瘤抑制基因 ；：谷胱苷肽过氧化物酶 数据统计和分析试验数据采用 软件进行单因素方差分析（）后，用 程序进行 和 水平上的多重差异显著性比较。数据结果均以平均值标准误（?）表示。用 软件绘图。图 尿素中毒后山羊的临床症状.喜躺卧 ；尾巴下束 ；口鼻中有带泡沫样白色液体流出 图 各组山羊体重变化.：对照组 ；：尿素组 ；：尿素组 结果与分析 山羊尿素中毒后的临床症状及体重变化饲喂 尿素（）组山羊前期表现为采食量下降，磨牙，啃食墙皮和铁栏杆，精神萎靡，被毛耸立，后期表现喜躺卧（图），尾巴下束（图），行走不稳，躯体摇摆，呼吸急促且带有喘、齁症状；饲喂 尿素（）组羊前期表现为精神萎靡，被毛耸立，躯体摇摆，呼吸急促且带有喘、齁症状，后期口鼻中有带泡沫样白色液体流出（图），瞳孔扩大，眼球萎缩，腹部膨大，甚至出现急性死亡情况；对照（）组山羊采食和饮水正常。如图 所示，对照（）组山羊体重随时间的增加呈上升的趋势，组和 组山羊体重则呈下降趋势，且 组山羊下降趋势更明显。尿素中毒对山羊血氨和铁离子含量的影响由图 可知：与对照组相比，山羊饲喂尿素 后，尿素组和 尿素组血清中氨含量均极显著升高（）。饲喂 ，与对照组相比，尿素组和尿素组肾脏铁含量均极显著升高（）。尿素中毒对山羊氧化应激指标的影响由图 可见：饲喂 ，与对照组相比，尿素组和 尿素组肾脏 含量和 活性、活性均极显著降低（），而 含量均极显著升高（）。尿素中毒对山羊肾脏组织病理和超微结构的影响经 染色后光学显微镜观察各组山羊肾脏组织的病理变化。结果（图）表明：对照组肾组织结构形态完整，肾小管上皮细胞胞浆、胞核正常，未见肿胀，南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 尿素中毒对山羊血氨和铁离子含量的影响.；图 尿素中毒对山羊肾脏氧化应激指标的影响.肾小管管腔未见异物；尿素组可见大部分肾小管上皮细胞肿胀、变性、脱落，肾间质毛细血管充血、出血；尿素组可见大部分肾小管上皮细胞坏死，胞浆呈均质红染，胞核裂解消失。染色后观察结果显示：对照组山羊的肾组织中未见蓝色胶原纤维；尿素组肾组织中可见大量胶原纤维增生，几乎遍布肾小管周围；尿素组肾组织坏死，少量肾小管周围可见胶原纤维。制备肾脏超微病理切片后用透射电镜观察其超微结构变化。结果表明：对照组山羊肾小管上皮细胞结构正常，线粒体质膜完整，线粒体嵴可见；尿素组肾小管上皮细胞内可见线粒体明显皱缩，线粒体膜电子密度增加；尿素组肾小管上皮细胞核固缩，异染色质增多，线粒体肿胀，质膜断裂，膜嵴减少和断裂。尿素中毒对山羊肾脏铁死亡通路相关基因表达的影响 结果显示：与对照组相比，尿素组和 尿素组组织内相关基因、表达水平均极显著升高（），尿素组、表达水平极显著升高（），尿素组 表达水平有上升趋势，而 和 表达水平下降；与对照组相比，尿素组和 尿素组 表达水平极显著下降（）。尿素中毒对山羊肾脏 蛋白表达的影响用 分析不同水平尿素对山羊肾脏中的 蛋白的表达水平影响。结果如图 所示，与对照组相比，尿素组 蛋白的表达水平显著降低（），尿素组 蛋白的表达水平极显著降低（）。这表明添加尿素可导致 蛋白表达量下降。第 期郝宁浩，等：尿素中毒对山羊肾脏氧化应激及铁死亡指标的影响图 尿素中毒对山羊肾脏组织病理以及超微结构的影响.尿素组红色箭头示肾小管上皮细胞变性、脱落，黑色箭头示肾间质毛细血管出血，体膜电子密度增加。尿素组蓝色箭头示肾小管上皮细胞坏死和断裂。，（）（）（）：细胞核；：线粒体 图 尿素中毒对山羊肾脏铁死亡信号通路相关基因 表达变化.图 检测（）尿素中毒对山羊肾脏 蛋白表达水平（）的影响.（）（）讨论目前，尿素中毒的研究多数是关于中毒后的临床诊断、剖检病理变化及防治处理等，其中尿素中南 京 农 业 大 学 学 报第 卷毒引起的肝脏损伤在多种动物中已有报道，而尚无对其肾脏病理学变化及损伤机制的报道。已知重金属和药物也可引发肾脏的损伤，吴培福等研究发现氟中毒会导致肾小管排列结构轻微紊乱，肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞发生变性、坏死，肾小管内脱落的上皮细胞增多。郭亚楠等研究发现汞中毒会导致肾小管弥漫性坏死和肾小球坏死且出现蛋白管型等。等研究发现啶虫脒会导致肾小管扩张和管腔内的小管细胞脱落。孙诗谣等研究发现十溴联苯醚（）会导致肾小球增大，内容物增多，肾小管水肿及胞质疏松。而尿素中毒主要表现为肾小管上皮细胞肿胀、变性、脱落，胞浆均质红染，胞核裂解消失。通过比较发现，以