毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究_李紫阳.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：09170926Journal of Nuclear Agricultural Sciences毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究李紫阳 杨克彬 朱成磊 刘燕 郭栋 肖晓燕 高志民*（国际竹藤中心竹藤资源基因科学与基因产业化研究所，国家林业和草原局/北京市共建竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102）摘 要：ATP结合盒转运蛋白G亚家族（ABCG）在植物体内的物质运输过程中发挥着重要作用。为探究毛竹（Phyllostachys edulis）中ABCGs的分子特征、表达模式及转录因子对PeABCG15的调控关系，本研究利用生物信息学方法鉴定毛竹ABCG基因家族成员，对其基因结构、编码蛋白的理化性质和系统进化等进行系统分析，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对毛竹ABCG基因表达模式进行研究，借助酵母单杂交验证转录因子与ABCG基因的调控关系。结果表明，在毛竹基因组中共鉴定到77个ABCG基因（PeABCG1PeABCG77），其启动子中含有多种激素和非生物胁迫响应元件，其中脱落酸响应元件ABRE最多，出现在74个基因的启动子中。系统进化分析发现，PeABCGs分为白棕色复合体（WBC）和多效性耐药复合体（PDR）两个亚组，与水稻的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示，在脱落酸（ABA）处理后，7个与ABA运输相关的PeABCGs中有6个呈上调表达趋势，而未检测到PeABCG34表达；在低温处理条件下，7个PeABCGs均受到诱导表达；在干旱处理条件下，有2个PeABCGs的表达受到抑制，其余基因的表达均受到不同程度的诱导。另外，随着竹笋木质化程度增加，PeABCG15呈持续上调表达趋势，并与木质素合成调控转录因子基因PeKNAT3和PeMYB42的表达趋势一致。酵母单杂交试验证实，PeKNAT3和PeMYB42均能与PeABCG15的启动子结合。由此表明，PeABCGs参与毛竹抗逆可能存在ABA介导和非介导两种方式，其中PeABCG15受ABA诱导，且可能通过促进木质素合成参与毛竹抗逆。本研究结果为揭示毛竹中ABCG的功能提供了参考。关键词：毛竹；ABCG；分子特征；表达模式DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0917ATP 结 合 盒 转 运 蛋 白（ATP-binding cassette transporters，ABC）是生物体中最大的转运蛋白家族1，该类蛋白利用 ATP 水解产生的能量驱动物质运输。ABC转运蛋白家族包括8个亚家族，其中ABCG是最大的亚家族2，该亚家族又分为白棕色复合体（white-brown complex，WBC）和多效性耐药复合体（pleiotropic drug resistance，PDR）。WBC 是半分子 ABCG 转运蛋白，具有一个核心单位；PDR 是全分子 ABCG 转运蛋白，具有两个核心单位3。每个核心单位由两个基本结构组成，即 ABC 转运蛋白特异性核苷酸结合域（nucleotide-binding domain，NBD）和疏水跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）。NBD是由大约200个氨基酸残基组成的保守区段，包含 Walker A、Walker B、ABC signature基序以及Q环和H环4，TMD通常由46个疏水的-螺旋组成5。ABCG在植物中已有广泛研究，在植物激素运输、表皮角质层形成、次生代谢产物分泌、抵抗生物和非生物胁迫等方面起重要作用6。研究表明，植物通过表面形成角质层来保护自身免受外界侵害，而ABCG参与植物表面物质形成的运输，其中拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtABCG1和AtABCG16 参与花器官相关表皮的角质组分运输7。ABCG介导植株体内重金属离子的外排，减少其对植物的毒害作用，如AtABCG36和AtABCG40可分别参与Cd2+和Pd2+的细胞外排8-9。ABCG还可参与木质素单体的转运，如AtABCG29是H型木质素单体香豆醇的转运蛋白10。另外，ABCG在植物体内广泛参与多种激素的运输，拟南芥中的ABCG25、ABCG30、ABCG31和ABCG40是脱落酸（abscisic acid，ABA）的转运体，分别在植物不同组织部位起输入或输出 ABA 的作用11。文章编号：1000-8551（2023）05-0917-10收稿日期：2022-07-05 接受日期：2022-10-18基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD2200502）作者简介：李紫阳，女，主要从事毛竹分子育种研究。E-mail：*通讯作者：高志民，男，研究员，主要从事竹藤生长发育的分子基础研究。E-mail：917核农学报37 卷 拟南芥ABCG36和ABCG37是两个在根部高表达的蛋白，参与生长素前体吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）的运输，调控细胞内生长素动态平衡12-13。植物激素作为协调植物细胞活动的一类小分子化学信号物质，可通过多种方式调节植物的生长发育，尤其是可以参与抵御逆境胁迫过程，其中 ABA 发挥着重要作用14-15。另外，ABA可以调节木质素合成调控网络中的遗传调控因子，促进次生壁形成，从而提高抗逆性16。毛竹（Phyllostachys edulis）属于禾本科竹亚科刚竹属，具有生长快、适应能力强的特点，在我国栽培面积大，占全国竹林总面积的 72.96%17，且产量高，物理性能佳，是木材的良好替代品。低温和干旱等胁迫因素是制约毛竹竹材和竹笋产量和质量的主要非生物因素，目前在毛竹中已鉴定到多个基因参与到抗逆过程中，如Phehdz118、PeEXs19、NAC20、WRKY21等转录因子基因均受到低温或干旱胁迫的诱导。然而，激素作为植物响应非生物胁迫的重要信号分子，目前在竹子中关于运输的研究甚少，而ABCG作为重要的激素转运蛋白在竹子中的研究仍几乎处于空白。因此，本研究以毛竹为对象，在全基因组水平筛选并鉴定ABCG基因成员，综合分析其基因结构、蛋白保守结构域、进化关系以及其启动子中的作用元件，利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术分析不同激素和非生物胁迫处理后ABA运输相关ABCG基因的表达模式，以期为深入研究ABCG基因家族在毛竹激素运输以及抗逆过程中的功能提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料在人工气候室条件下（温度25，相对湿度80%，光16 h/暗8 h）培养毛竹实生苗，2个月时选择长势一致的幼苗，将其随机分为三组。第一组用100 molL-1的ABA溶液对叶片进行喷施处理；第二组将实生苗放入 4 培养箱中进行低温处理；第三组用 20%PEG-6000溶液浇灌至饱和，模拟干旱处理22。每个处理至少有20株幼苗，且均包含3次重复。分别在处理后0、3、6 h后收集各组毛竹自上而下第2片嫩叶，液氮速冻后存于-80 冰箱备用。以江西省南昌市野生毛竹林（11546 E，2845 N）中的毛竹笋为研究材料，选择长势良好的毛竹笋，采集代表竹笋生长趋势的5个不同高度（1.0、2.0、4.0、6.0和 8.0 m）的笋，选取地上第 15 节间（毛竹成竹胸高处），取该节间的上部作为试验材料。样品经液氮处理后，存于-80 冰箱，用于研究关键ABCG基因在不同高度笋中的表达模式。1.2试验方法1.2.1毛竹 ABCG 基因家族成员的鉴定分别从Rice Genome Annotation Project（http：/rice.plantbiology.msu.edu/）和TAIR（https：/www.arabidopsis.org/index.jsp）数据库下载水稻和拟南芥ABC家族成员的氨基酸序列作为诱饵，在毛竹新版本基因组数据库BambooGDB（http：/bamboo.bamboogdb.org/）中进行 BLASTP 比对分析，利用HMMER（https：/www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART数据库（http：/smart.embl-heidelberg.de）对获得的候选序列逐条进行蛋白保守结构域的鉴定分析，删除没有典型结构域ABC transporter（PF00005）以及该结构域不完整的序列，得到毛竹 ABC 家族成员。利用MEGA 7.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统进化树，重复次数为1 000，其他参数使用系统默认值23。并以水稻ABC基因家族分类为依据24，对毛竹ABC基因家族进行分类，最终得到毛竹ABCG亚家族成员。利用ProtParam（http：/web.expasy.org/protparam/）网站对毛竹ABCG蛋白长度、分子量及等电点等理化性质进行分析，并使用 Plant-mPLoc 在线网站（http：/ Server v 2.0（http：/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构域。利用TBtools分析毛竹ABCG亚家族成员的基因结构，利用 Plant CARE（http：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库对基因上游 2.0 kb 序列进行顺式作用元件和应答元件分析，通过在线软件MEME（https：/meme-suite.org/tools/meme）对毛竹ABCG蛋白的保守基序进行分析。1.2.2毛竹ABCG亚家族成员系统进化分析利用MEGA 7.0内置的 ClustalW 软件对水稻的 ABCG氨基酸序列进行多序列比对分析，并构建NJ系统进化树，重复次数为1 000，其他参数使用系统默认值23。通过TBtools内置的BLASTP程序对毛竹和水稻ABCG的氨基酸序列进行多向比对，参考文献 25 设置参数，鉴定毛竹中以及毛竹与水稻中具有共线性关系的基因，使用TBtools内置的MCScanX程序进行可视化。同时，利用TBtools对毛竹ABCG同源基因对之间的同义（Ks）和非同义（Ka）核苷酸替换率进行计算。1.2.3毛竹关键 ABCG 基因的表达模式分析使用总RNA提取试剂盒（简石，中国）提取不同处理毛竹叶片、不同高度笋第 15 节上部的总 RNA，并反转录为9185 期毛竹ABCG基因鉴定及其表达模式研究cDNA，存于-20 冰箱。利用Primer Premier 5软件设计毛竹ABCG基因序列特异的定量引物（表1），由北京睿博兴科生物科技有限公司合成。使用qTOWER荧光定量PCR仪（耶拿，德国），以PeNTB为内参基因26，反应体系共10 L：2SYBR Green I Master 5.0 L、正向和反向引物各0.2 L、cDNA模板0.8 L、ddH2O 3.8 L。PCR扩增程序：95 预变性5 min；95 变性10 s，62 退火10 s，44个循环。采用2CT法分析基因的相对表达量27，并使用 OriginPro 软件绘制表达量图。1.2.4共表达网络构建与酵母单杂交根据毛竹木质化调控网络28，利用现有毛竹不同高度笋的转录组数据，基于加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）构建以PeABCG15为核心的共表达网络，筛选与之共表达的转录因子。根 据 PeABCG15 启 动 子 序 列 以 及 转 录 因 子 基 因PeKNAT3（PH02Gene30737）和 PeMYB42（PH02Gene08106）序列，利用Primer Premier 5软件设计引物，用于目的序列扩增，并分别构建到pHIS2和pGADT7-Rec2表达 载 体 中，命 名 为 pHIS2-PeABCG15pro、pGADT7-Rec2-PeKNAT3和pGADT7-Rec2-PeMYB42，将pGADT7-Rec2-PeKNAT3