一例猪流行性腹泻病毒与致病...肠杆菌混合感染的诊断及分析_李梓健.pdf

第 1 期收稿日期：2021-11-10基金项目：黑龙江八一农垦大学“三横三纵”团队项目（TDJH201804）。作者简介：李梓健（1997-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院 2020 级硕士研究生。通信作者：孙东波，男，教授，博士研究生导师，E-mail：。一例猪流行性腹泻病毒与致病性大肠杆菌混合感染的诊断及分析李梓健，朱庆贺，邢晓旭，宋军，苏明俊，李璐，赵飞宇，赵鹏宇，孙东波（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）摘要：为明确齐齐哈尔市泰来县某猪场引起哺乳仔猪腹泻的病因，试验采集腹泻仔猪的粪便样品，通过 PCR 检测、细菌分离培养、16S rRNA 序列测定、同源比对分析以及分离菌株的致病性试验等对腹泻仔猪的病原进行了鉴定，同时对分离菌株进行药敏试验。结果表明：在腹泻仔猪粪便样本中猪流行腹泻病毒（PEDV）呈阳性；从病料中分离出的菌株与大肠杆菌（KJ477007.1、MW301234.1 等）的同源性均超过 99%；将分离菌株以腹腔接种的方法注射给 BALB/c 小鼠，约 20 h 后接种分离菌株的小鼠全部死亡，剖检和 HE 结果显示该分离菌株致病性较强；该分离菌株对头孢噻呋、头孢吡肟存在高度敏感性；对头孢喹肟和林可霉素存在中度敏感性；对庆大霉素、恩诺沙星、卡那霉素、氟苯尼考以及阿奇霉素存在耐药性。说明该猪场的仔猪腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒和致病性大肠杆菌的混合感染所致，在进行治疗时，应结合药敏试验的结果进行用药。关键词：猪流行性腹泻病毒；致病性大肠杆菌；混合感染；动物致病性试验中图分类号：S858.28文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）01-0033-08Mixed Infection Diagnosis and Analysis of Procine Epidemic DiarrheaVirus and Pathogenic Escherichia ColiLi Zijian，Zhu Qinghe，Xing Xiaoxu，Song Jun，Su Mingjun，Li Lu，Zhao Feiyu，Zhao Pengyu，Sun Dongbo（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）Abstract：To clarify the diarrhea pathogens of suckling piglets in a pig farm in Tailai，Qiqihar City.The fecal samples of diarrhealpiglets were collected in this study.They were detected by RT-PCR，isolation and identification of bacteria，16S rRNA sequencing，homology analysis and animal pathogenicity test.Meanwhile，drug sensitivity test was carried out on the isolated strains.The resultsshowed that the porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）was positive in diarrheal piglet samples.In addition，the homology betweenthe strains isolated from disease materials and Escherichia coli（KJ477007.1，MW301234.1，etc.）reached more than 99%.Theisolated strain was inoculated into BALB/c mice by intraperitoneal inoculation.After 20 hours，all the mice of the group died.Theresults of pathological necropsy and HE showed that the isolated strain was highly pathogenic.The isolated strain was highly sensitiveto ceftiofur and cefepime，moderately sensitive to cefquinoxime and lincomycin.Moreover，it was resistant to gentamicin，enrofloxacin，kanamycin，florfenicol and azithromycin.The results indicated that the diarrhea of piglets in this pig farm was caused by the mixedinfection of PEDV and pathogenic Escherichia coli.What s more，the medication should be combined with the results of drugsensitivity test during the viral treatment.Key words：porcine epidemic diarrhea virus；pathogenic Escherichia coli；mixed infection；animal pathogenicity testdoi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.01.006第 35 卷第 1 期2023 年2 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（1）：3340Feb.2023猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）引起的急性高接触性猪肠道传染病。一年四季皆会发生，而春、冬两个季节为猪流行性腹泻最高发的季节1。临床症状主要表现为哺乳仔猪的厌食、脱水、排出水样稀粪2。一周龄内的新生仔猪极易感染，死亡率高达 100%3。致病性大肠杆菌是猪大肠杆菌病的病原，猪大黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷肠杆菌病也是猪群中常见的腹泻性疾病，具有较强的传染性4。大肠杆菌是动物肠道中一种重要菌群，一般情况下不具有致病能力，而个别血清型的大肠杆菌对许多种生物致病5，在临床上能引起动物的腹泻以及肠毒血症。7 日龄左右的仔猪在感染致病性大肠杆菌后会表现出黄痢；30 日龄左右的仔猪在感染致病性大肠杆菌后会表现出白痢；断奶前后仔猪感染致病性大肠杆菌后会出现水肿病6，这些症状都会加重病毒感染后的腹泻，同时也会提高仔猪的死亡率，所以猪大肠杆菌病同样对猪养殖业造成了一定的经济损失。2018 年 7 月，齐齐哈尔市泰来县某猪场中 75%的 215 日龄仔猪陆续出现呕吐、厌食水样腹泻等现象。随着病程发展，发病仔猪出现消瘦、四肢无力、精神萎靡、被毛粗乱和食欲废绝等病症，最后脱水衰竭死亡，病程约为 25 d。初步统计发现，仔猪日龄越小，整体症状越严重，而耐过仔猪出现生长迟缓、体质弱以及抵抗能力差等现象。试验采集腹泻仔猪的粪便样品，利用 PCR 检测和细菌分离鉴定等方法对腹泻仔猪进行诊断，并通过动物致病性试验分析分离菌的致病性，以明确引起该猪场腹泻的病原，为猪场腹泻疾病的预防及治疗提供理论依据。1材料和方法1.1 材料1.1.1 病料来源采集齐齐哈尔市泰来县某猪场腹泻仔猪的粪便样品，于-80 保存备用。1.1.2 试验动物67 周龄健康雌性 BALB/c 小鼠共 10 只，平均重量约为 1922 g，购于哈尔滨医科大学。1.1.3 主要试剂病毒 RNA 提取试剂盒，购于北京市天根生化科技有限公司；Reverse Transcriptase、dNTPs（10 mM）、Recombinant RNase Inhibitor，均购于上海市近岸科技有限公司；2Premix Taq 预混酶、琼脂糖 Agarose，购于北京市宝日医生物技术有限公司；50TAE，购于北京市索莱宝科技有限公司；革兰氏染色液，购于上海市源叶生物科技股份有限公司；药敏纸片，购于常德市比克曼生物科技有限公司。1.1.4 主要仪器PCR 仪，购于德国 Analytikjena 公司；凝胶成像系统，购于赛默飞世尔科技有限公司；电泳仪电源、水平核酸电泳槽，均购于美国 Bio-Rad 公司；高压灭菌锅，购于松下电器公司；超净工作台、恒温培养箱，均购于上海市博迅科技有限公司；涡旋振荡器、金属水浴锅，均购于韩国 DAIHAN 公司；恒温摇床，购于上海市南荣实验室设备有限公司；光学显微镜，购于德国卡尔蔡司公司。1.1.5 引物的设计与合成参照文献合成 PEDV ORF3 基因和致病性大肠杆菌 F18 黏附素基因的特异性引物7-8。两对引物均由上海市生工生物工程股份有限公司所制备，引物序列见表 1。表 1引物序列信息Table 1Primer sequence information目的基因ORF3F18名称ORF3-FORF3-RF18-FF18-R引物序列P1 5-CTAGACTTCAACCTTAC-3P2 5-GGTGACAAGTGAAGCACAGA-3P1 5-GGATCCCAGCAAGGGGATGTTA-3P2 5-CTGAATTCCTTGTAAGTAACCGCGT-3片段长度/bp8274611.2 方法1.2.1 病毒的 PCR 检测称取 1 g 腹泻仔猪病料放置于 1.5 mL EP 管中，向 EP 管中加入 1 mL PBS，剧烈振荡 5 min，4 000 g离心 20 min，移取离心分离后的上清液至新的 1.5 mLEP 管中。参照说明书提取病毒 RNA，并进行反转录合成 cDNA，以其作为模板对 PEDV ORF3 基因进行PCR 扩增8，扩增后片段大小约为 827 bp。反转录体系及试验步骤如下：病毒 RNA 6 L，随机引物 1.5 L，5Reaction Buffer 6 L，dNTP 3 L，反转录酶 1.5 L，RNA 酶抑制剂 0.75 L，加 ddH2O至30 L，42 水浴 30 min，70 水浴 5 min 终止反应。PCR 扩增体系及试验步骤如下：cDNA 1 L，上游引物与下游引物各 1 L，2premix 12 L，加ddH2O 至 25 L 体系。ORF3 基因扩增条件如下：94 预变性 5 min，94 变性 30 s，50 退火 45 s，34第 1 期72 延伸 1 min，循环数为 35，72 延伸 10 min。取5 L 扩增后的 PCR 产物进行浓度为 1.0%的琼脂糖凝胶电泳。1.2.2 细菌的分离鉴定将采集的腹泻仔猪病料用双蒸水稀释混匀后，移取 100 L 混合液涂布于血琼脂培养基上9，然后在 37 下培养 24 h，再挑取单一的菌落转移到 LB液体培养基中 37、200 rpm 培养 1012 h。以增殖的菌液为模板，进行 PCR 扩增10，PCR 扩增体系及试验步骤如下：以 10 L 微量移液器蘸取少量菌液作为模板，上游引物和下游引物各 1 L，2premix 12.5 L，加 ddH2O 至 25 L 体系。F18 基因扩增条件如下：94 预变性 90 s，94 热变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 30 s，循环数为 30，72 延伸5 min。取 5 L 扩增产物进行浓