一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价_娄向弟.pdf

研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)143DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 032996引用格式:娄向弟，张向向，贺江，等 一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价J 食品与发酵工业，2023，49(5):143 150 LOU Xiangdi，ZHANG Xiangxiang，HE Jiang，et al Isolation and identification of a Bacillus venezensis and its pro-biotic potential evaluation J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):143 150一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价娄向弟1，2，张向向2，贺江2，莫德钱1，王永慧2，熊建华1，郜彦彦1*1(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌，330045)2(江苏沿海地区农业科学研究所，江苏 盐城，224002)摘要贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为芽孢杆菌属新型细菌。采用梯度稀释法及抑菌圈法进行菌株的分离和筛选，综合形态观察和 16S rDNA 序列比对对分离的菌株进行鉴定。通过高盐、胆盐、pH、模拟胃肠液、温度和抗生素等耐受性测定，结合体外抗氧化能力、抑菌活性以及溶血和动物饲喂试验，对分离菌株进行益生潜力评价。结果显示，从农家酱中分离出一株菌 PJP10，初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、青枯雷尔氏菌(alstonia solanacearum)和黑曲霉(Aspergillus niger)等拮抗效果显著，可以耐受 8%NaCl、0 5%胆盐、100 水浴、pH 2 和模拟胃肠道的环境，对于头孢类、阿奇霉素等 14 种常用抗生素敏感。同时菌株 PJP10 无菌发酵液具有较好的抗氧化活性，对 ABTS 阳离子和 DPPH 自由基的清除率分别为(95 66 3 1)%和(44 84 2 2)%，Fe3+还原能力和 Fe2+螯合率分别为(3019 3 7)mol/L 和(76 88 2 2)%。此外，安全性试验表明无溶血圈，彭泽鲫饲喂未见异常。综上，贝莱斯芽孢杆菌 PJP10 具有良好的益生潜力，在食品行业中具有较高的应用价值。关键词贝莱斯芽孢杆菌;益生特性;耐受性;抑菌;抗氧化活性第一作者:硕士，研究实习员(郜彦彦讲师为通信作者，E-mail:gaoyy02 hotmail com)基金项目:江西省教育厅科技项目(GJJ160414);江西省现代农业产业技术体系项目(JXAS-3)收稿日期:2022-07-15，改回日期:2022-08-08贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是2005 年由UIZ-GACA 等1 发现，为革兰氏阳性好氧细菌，内生孢子，是芽孢杆菌属(Bacillus)的新种，一种新型细菌2。近年来国内外对贝莱斯芽孢杆菌的研究越来越多，主要集中在生物防治3、药物研发4、食品发酵5 和工业酶制剂6 7 等领域。贝莱斯芽孢杆菌来源非常广泛，不同生境分离得到的贝莱斯芽孢杆菌功能也不完全相同8，有研究表明贝莱斯芽孢杆菌 L-1对梨灰霉和青霉病菌有抑制作用，能引起病原菌菌丝膨大、畸形9。贝莱斯芽孢杆菌 JW-5 5 能够抑制禾旋孢腔菌(Cochlioboluss ativus)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)和 梨 黑 斑 病 菌(Alternariakikuchiana Tanaka)等多种农作物病害，具有多种羊毛硫抗生素、套索肽、细菌素等抗菌肽基因簇10。而来自发酵海洋鱼酱油中的贝莱斯芽孢杆菌 SW5 对食品中多种常见病原菌具有明显的抑菌活性，发酵上清液中含有多种抑菌物质11。益生菌是一类能够在宿主体内存活并发挥有益作用的微生物，具有维持肠黏膜屏障，调节免疫功能和促进营养物质的代谢吸收等重要功能12。具有酸和胆汁的耐受性，是益生菌在小肠中生存和发挥益生作用的重要因素13。抗生素敏感、抑制肠道中的致病菌生长，调节肠道菌群平衡，也是益生潜力评价的重要环节14 15。本实验室从农家酱中分离得到的一株有抑菌活性的分离株 PJP10，对其进行生理生化和16S rDNA 测序比对分析。通过耐受性测定、抗氧化活性分析和安全性试验来评价该菌株的益生潜力，为其在食品方面的开发和应用提供研究基础。1材料与方法1 1材料与设备1 1 1实验材料农家酱，市售。指示菌:肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、酿酒酵母、白色念珠菌、黑曲霉，本实验室保存;铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌，上海嘉楚生物工程有限公司;副溶血性弧菌，北纳生物技术研究院;青枯雷尔氏菌(辣椒青枯病病原菌)、黄单胞杆菌(柑橘溃疡病病原菌)、刺盘孢菌(梨炭疽病病原菌)，江西农业大学农学院果蔬保藏实验室。胰蛋白胨、琼脂粉、蛋白胨，生工生物工程(上食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES1442023 Vol.49 No.5(Total 473)海)股份有限公司;酵母膏、NaCl，天津市福晨化学试剂厂;DPPH、ABTS、三吡啶三吖嗪(tripyridine tria-zine，TPTZ)、过硫酸钾，美国 Sigma 公司;16 种药敏纸片，杭州滨河微生物试剂有限公司;其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯级。1 1 2培养基LB 培养基(g/L):NaCl 10 0、蛋白胨 10 0、酵母粉 5 0。固体培养基另加 2%(质量分数)琼脂粉，121，灭菌 20 min 后备用。不同 pH 培养基:用稀 HCl 溶液和 NaOH 溶液将LB 培养基的 pH 调为 2 0、3 0、4 0、5 0、6 0、7 0、8.0、9 0、10 0，灭菌备用。高盐培养基:LB 培养基中 NaCl 质量分数调整为8%，灭菌备用。胆盐培养基:LB 培养基中加入胆盐，使胆盐的质量分数分别为 0 1%、0 3%、0 5%，灭菌备用。1 1 3仪器与设备FA2104 电子天平，上海菁海仪器有限公司;SW-CJ 洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Spcord200 紫外可见分光光度计，德国耶拿分析仪器股份有限公司;HC-2518 高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1 2实验方法1 2 1菌株的分离称取农家酱 5 g，加入 100 mL 灭菌水，180 r/min摇床振荡20 min，制成菌悬液，吸取1 mL 菌悬液进行梯度稀释，分别取103、104、105三个梯度均匀涂布在 LB 固体平板上，30 培养 48 h 后挑取单菌落，纯化至纯培养保存，此为分离菌。1 2 2菌种活化与培养从 80 冰箱中取出冻存的菌液，划线到 LB 固体平板，37 培养箱过夜培养，然后取培养好的单菌落转接至 50 mL LB 液体培养基中，37、180 r/min摇床培养 36 h，作为种子液。无菌发酵液制备:以 2%接种量(体积分数，下同)转接种子液至 250 mL LB 液体培养基中，37、180 r/min 培养 36 h，4、10 000 r/min 离心 10 min，收集上清液，并用 0 22 m 滤膜过滤，作为无菌发酵液。1 2 3菌株的筛选和鉴定以金黄色葡萄球菌为指示菌，制备成菌悬液(1 108CFU/mL)，均匀涂布到 LB 固体平板上，晾干后，加入 5 L 分离菌种子液，30 培养 1 2 d，选取能产生抑菌圈的分离菌进行革兰氏染色和 16S rDNA测序。采用 16S rDNA 测序法鉴定 PJP10 菌株，选择通用引物27F(5-GTTTGATCMTGGCTCAG-3)和1492(5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3)进行 PC 扩增，PC 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，使用 MEGA 5 1 软件进行系统发育树构建。1 2 4PJP10 菌株的耐受性评价1 2 4 1pH 耐受性按 2%接种量将活化后的 PJP10 种子液接种到不同 pH 的 LB 液体培养基中，37，180 r/min 培养36 h 后，测定不同 pH 值培养的 OD600。1 2 4 2高盐耐受性按2%接种量转接种子液到高盐培养基，37 培养 36 h，平板菌落计数检测其盐耐受性。1 2 4 3高温耐受性参考刘秀侠等16 的测定方法，略作修改。将 2瓶种子液分别于 80 和 100 水浴 10 min，以 10%的接种量转接至新鲜的 LB 液体培养基中，37 培养，测定 0 和 36 h 的 OD600，判断其耐热性。1 2 4 4胆盐耐受性以 10%的 接 种 量，将 种 子 液 分 别 接 种 至 含0.1%、0.3%、0.5%胆盐的 LB 培养基中，37 水浴4 h，平板菌落计数检测胆盐耐受性。1 2 4 5胃肠液耐受性以 10%的接种量，将种子液分别接种于人工胃液和人工肠液17 中，37 水浴 3 h，平板菌落计数分别检测胃液和肠液中 PJP10 菌株的耐受性。1 2 4 6抗生素耐受性采用 K-B 纸片扩散法(Kirby-Bauer disk diffusionmethod)测定抗生素敏感性，将种子液用生理盐水梯度稀释，将菌浓度稀释到 1 108CFU/mL，再吸取50 L 稀释后的菌液均匀涂布在 LB 固体培养基上，晾干后分别将 16 种抗生素药敏纸片放入平板中，37 培养 24 h 后，观察抑菌效果并测量抑菌圈直径。1 2 5PJP10 菌株的抑菌能力测定将活化好的指示菌种子液，采用梯度稀释法用生理盐水稀释至所需的菌悬液浓度(1 108CFU/mL)。取 50 L 指示菌悬液，细菌涂布于 LB 固体平板上，研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)145真菌涂布于 PDA 平板上。抑制细菌试验采用打孔法，在各孔内分别加入 100 L PJP10 无菌发酵液，以100 L 无菌 LB 液体培养基为阴性对照，37 培养24 h 后观察并测量抑菌圈直径。拮抗真菌试验在涂好指示菌的平板上滴加 5 L PJP10 种子液，以 5 L无菌 LB 液体培养基为阴性对照，30 培养 3 5 d，观察并测量抑菌圈直径。1 2 6PJP10 菌株自由基清除能力测定ABTS 阳离子自由基清除能力:参考孟歌等18 的测定方法，略作改动。用去离子水稀释 ABTS 阳离子母液，稀释至其 OD734=0 70 左右，30 避光平衡30 min，得到 ABTS 阳离子工作液。吸取200 L 无菌发酵液，加入 2 0 mL ABTS 阳离子工作液，混匀后25 避光放置 20 min，于 734 nm 处测定吸光值，ABTS 阳离子自由基的清除率按公式(1)计算。ABTS 阳离子自由基清除率/%=1 A样品 A空白A()对照100(1)式中:A样品、A空白和 A对照分别是样品组、样品空白组(以去离子水替代 ABTS 溶液)和对照组(去离子水替代样品)的吸光值。DPPH 自由基清除能力:参考 TANG 等19 的测定方法，略作改动。吸取 2 0 mL 无菌发酵液加入到2.0 mL DPPH(0 2 mmol/L)溶液中，混匀后 25 避光反应 30 min，于 517 nm 处测定吸光值。DPPH 自由基的清除率按公式(2)计算。DPPH 自由基清除率/%=1 A样品 A空白A()对照100(2)式中:A样品、A空白和 A对照分别是样品组、样品空白组(以无水乙醇替代 DPPH 溶液)和对照组(以无水乙醇替代样品)的吸光值。1 2 7铁离子还原能力的测定参考 BENZIE 等20 的测定方法，略作改动。首先取 2 5 mL TPTZ 溶液(0 01 mol