慢性牙周炎病变位点EB病毒...SFRP1含量之间的相关性_史文秀.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.130牙周炎是一类复杂的感染性疾病，学者广泛认为菌斑生物膜中的致病菌及其代谢产物与宿主之间相互作用是牙周炎致病的主要原因1,2。有学者认为 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种假定的牙周病原体3，疱疹病毒感染可能会诱导免疫抑制和细菌过度增殖，并可能将牙龈炎转变为牙周炎，或将稳定的牙周炎转变为进行性疾病4白介素-1（interleukin-1，IL-1）是单核细胞/巨噬细胞产生的促炎细胞因子之一，是牙周组织在受到外界刺激后激活免疫应答后产生，在牙周炎患者的唾液和牙龈组织中表达上调5,6。IL-1 含量随慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）加重而增多，IL-1 可以作为牙周炎的标记物7。分泌型慢性牙周炎病变位点 EB 病毒感染与 IL-1 和SFRP1 含量之间的相关性史文秀 刘惠萍 赵雪莹 李维善【摘要】目的通过检测慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）患者龈下菌斑中 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、龈沟液中白介素-1（interleukin-1，IL-1）和分泌型卷曲相关蛋白 1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）的含量，探讨 EBV 感染与 IL-1 和 SFRP1 相关性，进而探讨 EBV 与 CP 进展的相关性。方法 选取 CP 患者轻度 23 例、中度 23 例、重度 24 例以及牙周健康者 15 例作为健康对照组，提取龈下菌斑及龈沟液，应用 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 方法检测龈下菌斑中 EBV 的 DNA 载量，应用 ELISA 法检测龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 含量。结果 轻、中、重度 CP 病变位点及牙周健康位点中 EBV 的阳性检出率分别为30.4%、43.5%、75%和 13.3%，重度 CP 病变位点中 EBV 阳性检出率显著高于牙周健康位点（P 0.01）。轻、中、重度 CP 病变位点中 EBV DNA 载量均高于牙周健康位点，差异具有统计学意义（P 0.01），EBV 的载量随CP 的加重而不断升高（P 0.05）。IL-1 和 SFRP1 在不同程度 CP 位点中的总量和浓度均高于牙周健康位点（P 0.05）,IL-1 和 SFRP1 的浓度和含量均随 CP 的加重而不断升高（P0.05）；CP 病变位点中 EBV DNA 的载量与龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 的浓度和总量均呈正相关关系。结论 EBV 的感染可加重 CP 的严重程度，EBV的活动性感染可能加重 CP 的炎症进而引起附着丧失。【关键词】慢性牙周炎；EB 病毒；白介素-1；分泌型卷曲相关蛋白 1【中图号】R781.4【文献标识码】A 【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.01.006Correlation between subgingival infection of Epstein-Barr virus and the content of IL-1 and SFRP1 in the lesion site of chronic periodontitis SHI Wen-xiu,LIU Hui-ping,ZHAO Xue-ying,LI Wei-shan.Department of Periodontology，The Affiliated Stomatology Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154007,China【Abstract】Objective To investigate the contents of Epstein-Barr virus(EBV)in subgingival plaque,interleukin-1(IL-1)and secreted frizzled-related protein 1(SFRP1)in gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis(CP),and the correlation between EBV infection and IL-1 and SFRP1.Methods Twenty-three cases of mild,23 cases of moderate,24 cases of severe CP patients and 15 periodontal healthy patients as controls were selected.Subgingival plaque and gingival crevicular fluid were extracted,EBV DNA load in the subgingival plaque was detected by quantitative real-time PCR.The contents of IL-1 and SFRP1 in gingival crevicular fluid were detected by ELISA.Results The positive detection rates of EBV in mild,moderate and severe CP lesion sites and the control were 30.4%,43.5%,75%,and 13.3%,the detection rate of EBV in severe CP lesions was significantly higher than that in the control(P0.01).The EBV DNA load in mild,moderate and severe CP lesion sites was higher than that in the control(P0.01).The total amount and concentration of IL-1 and SFRP1 in CP were higher than those in the control(P0.05).The load of EBV DNA in CP sites was positively correlated with the concentration and total amount of IL-1 and SFRP1 in gingival crevicular fluid.Conclusions EBV infection can aggravate the severity of CP,and active infection of EBV may aggravate the inflammation of CP.【Key words】Chronic periodontitis;Epstein-Barr virus;Interleukin-1;Secreted frizzled-related protein 1基金项目：黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目（2019-KYYWF-1360）作者单位：154007 佳木斯 佳木斯大学附属口腔医院牙周病科通信作者：李维善，E-mail:,电话：15845408087北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.131卷曲相关蛋白 1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）是抑制 Wnt 信号通路的一种分泌型糖蛋白，参与骨代谢活动，促进成骨细胞与骨细胞的调亡8。研究显示 SFRP1 在 CP 患者龈沟液及牙龈组织中的表达升高且与牙周破坏相关，SFRP1 的异常表达可促进牙周炎的发生发展9。牙周炎是牙周支持组织结构遭到破坏的过程，其特征为牙齿周围的牙龈附着丧失和牙槽骨吸收10。本探讨不同程度的 CP 病变位点的 EBV 含量以及与临床指标之间的潜在关系，分析龈下菌斑样本中 EBV 与 IL-1 和 SFRP1 的相关性，探讨 EBV在 CP 病变位点的增殖情况以及在 CP 发生发展中的作用。材料和方法1.主要试剂SFRP1 酶 联 免 疫 试 剂 盒（沪 震 生 物，HZ-1334）；IL-1 酶 联 免 疫 试 剂 盒（上 海 生 工，D711068-0096）；柱式病毒 DNA 抽提试剂盒（上海生工，B518267）；2X SG Fast qPCR Master Mix 试剂（BBI,加拿大）；pMD 18-T 载体（TaKaRa，日本）。2.研究对象选取于 2019 年 12 月至 2020 年 9 月在佳木斯大学附属口腔医院牙周科就诊的 CP 患者 70 名，其中男 36 名，女 34 名，年龄 3459 岁，平均年龄（45.15.0）岁。15 名健康对照者均来自佳木斯大学附属口腔医院职工，其中男 8 名，女 7 名，平均年龄（39.82.7）岁。CP 的诊断标准1为：轻度 CP：探诊深度（probing depth，PD）4 mm，附着丧失（attachment loss，AL）：12 mm，X 线示牙槽骨吸收根长 1/3；中度 CP：PD 6 mm，AL：34 mm，X 线示牙槽骨吸收：1/3 6 mm，AL 5 mm，X 线示牙槽骨吸收：根长 1/2，本研究通过佳木斯大学医学伦理委员会审议批准（批号：JMSU-KQ-2021-002），参加研究的全体人员均知情同意并签署知情同意书。两组人群均需满足的纳入条件：排除全身性疾病，如糖尿病，心血管疾病，骨质疏松症，血液性疾病等，女性非妊娠；无吸烟史；半年内内未进行过牙周治疗，3 个月内未服用抗生素，激素，避孕药，抗凝药；口内无活动龋，无严重错牙合畸形，无黏膜疾病8。3.临床检查记录所有研究对象全口牙的 PD、出血指数（bleeding index，BI）、AL 于牙周检查记录表，CP患者拍摄全口曲面断层片。4.样本采集和处理取样位点为研究对象上颌第一磨牙的探诊深度最深的位点，牙周炎患者取样位点满足 PD 4 mm，AL 1 mm，并排除该位点是由于咬合创伤，不良修复体等其他因素造成的牙周破坏；健康者取样位点必须满足 PD 3 mm，AL=0 mm，BI 1。取样前清除龈上结石及菌斑，对取样位点消毒干燥。对龈沟液的采集使用滤纸条龈沟内吸附，间隔 5 min，重复操作 1 次，将滤纸条预先称重，将两次吸有龈沟液的滤纸条置于预先称重的 EP 管中，前后的质量差即龈沟液的质量，将装有 2 条滤纸条的 EP 管置于-80 冰箱冷冻保存备用。收集龈沟液后，用无菌刮治器伸至牙周袋底轻轻刮除龈下菌斑，置于 EP管，加入 250 l TE 缓冲液，放置于-80 冰箱保存。5.ELISA 法检测龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 含量从-80 冰箱中取出样本，冰上解冻，加入200 l ELISA 试剂盒中提供样本稀释液，在 4 离心机内 3000 r/min 离心 10 min，取上清液 200 l，其中 100 l 用于检测 SFRP1 水平，使用 SFRP1 酶联免疫试剂盒检测 SFRP1 浓度，进一步计算龈沟液中 SFRP1 的总量。100 l 用于检测 IL-1，使用 IL-1 酶联免疫试剂盒检测 IL-1 的浓度和总量。6.龈下菌斑中 EBV 含量的测定龈下菌斑 EBV DNA 的提取应用 Ezup 柱式病毒 DNA 抽提试剂盒进行。选取 EBV 高保守序列设计特异性引物11，正链引物序列为 5-AGTCC TTCTTGGCTACT