利用流式细胞术鉴定68份三角梅基因组大小与染色体倍性_陈宜木.pdf

接收日期：2022-11-18 接受日期：2022-12-14 基金项目：厦门市科技计划项目(3502Z20214ZD4001、3502Z20199008)*通信作者。E-mail: 利用流式细胞术鉴定利用流式细胞术鉴定 68 份三角梅基因组大小与染色体倍性份三角梅基因组大小与染色体倍性 陈宜木，周 群，钟颖颖，张万旗*，李可威，林悦其(厦门市园林植物园，福建 厦门 361000)摘 要：以国内外收集的 54 份三角梅(Bougainvillea)资源和 14 份实生种质为材料，选用番茄(Solanum lycopersicum)为内参，采用流式细胞术估测三角梅基因组大小，并以二倍体品种为对照，计算三角梅染色体倍性。结果表明：(1)所选用的内参与待检测样品的最高值能完全分开，没有重叠峰，峰型比较清晰集中，可以对三角梅基因组大小进行有效估测。(2)供试材料中有 34 份二倍体，基因组大小为 2.482.86 Gb；有 28 份三倍体，基因组大小为 3.654.22 Gb；有 5 份四倍体，基因组大小为 4.985.12 Gb；另外，大金边杨梅为 2X、4X、6X 混倍体。利用流式细胞法鉴定三角梅染色体倍性可缩短鉴定时间，提高鉴定效率。关键词：三角梅；流式细胞术；基因组大小；染色体倍性；育种 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2022.06.001 中图分类号：S685 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2022)06-0417-07 Genome Size Estimation and Ploidy Identification of 68 Servings Bougainvillea by Flow Cytometry CHEN Yi-mu,ZHOU Qun,ZHONG Ying-ying,ZHANG Wan-qi*,LI Ke-wei,LIN Yue-qi(Xiamen Botanical Garden,Xiamen 361000,Fujian China)Abstract:Using diploid variety tomato as the internal reference,the genome sizes of 54 collected germplasm at home and abroad and 14 seedlings of Bougainvillea resources were estimated by flow cytometry,and the chromosome ploidy was calculated with diploid as the control.The results showed that:(1)the peaks of the selected samples assayed were completely separated from that of the control without overlapping,and the peak shape was clear and concentrated,suggesting that the estimation of Bougainvillea genome size and ploidy was effective;(2)among the tested materials,34 germplasm were diploids with genome sizes of 2.482.86 Gb,28 germplasm were triploids with genome sizes of 3.654.22 Gb,5 germplasm were tetraploid with genome sizes of 4.985.12 Gb.In addition,a Bougainvillea germplasm resource Big Phnom Penh bayberry was identified as a mixoploid of 2X,4X and 6X.The usage of flow cytometry assay could shorten the time while improve the efficiency towards the identification of Bougainvillea chromosome ploidy.Key words:Bougainvillea;flow cytometry;genome size;ploidy;breeding 三角梅是紫茉莉科(Nyctaginaceae)叶子花属(Bougainvillea)中具有园艺价值的一类藤状灌木1，也叫叶子花、三角花、南美紫茉莉、九重葛、宝巾花、簕杜鹃、贺春红等，至今已有 250 多年的栽培历史2。我国自 1872 年在台湾省引种栽培3，随后渐扩至大陆各省。20 世纪 80 年代，福建、广东、2022,51(6):417423.Subtropical Plant Science 第 51 卷 418云南和海南等地开始大量引进三角梅优良品种，并逐步在我国南方大面积推广种植。三角梅因苞叶色彩丰富、花开繁茂，适应性强、耐修剪、易管理，应用范围广泛等特点而备受人们喜爱，现已被国内外 30 多个城市选为市花4。但是长期以来我国三角梅繁殖多采用扦插、嫁接等方式无性繁殖，最终导致品种单一、品性退化、基因池变窄，不利于三角梅种质资源库的扩大及品种创新5。因此，选育出更多的三角梅新品种刻不容缓。三角梅花被管细长，自然结实率低，且不同种质间结实性存在较大差异6，这与不同品种的花粉活力、花粉形态、柱头可授性有一定关系610。国外最初采用自然芽变育种11，后来采用辐射诱变和秋水仙素多倍体育种1217，育种效率大幅提升。在国内，陈庭等18、孙利娜等19、邓红等20先后开展了三角梅辐射诱变育种，获得了不同类型的变异植株，也有通过化学诱变选育新品种的研究，获得一些表型变异的植株2122。随着三角梅育性研究和新品种选育工作的深入开展，对三角梅染色体的倍性进行准确鉴定是非常必要的。孙鲁平23采用流式细胞分析法对 197 份三角梅种质染色体倍性进行鉴定，发现FormosaMrs.Eva White等 179 份种质为二倍体，斑叶画报等 17 份种质为三倍体，Chitra为四倍体，此外还发现Miss Manila的大花变异材料为 2n=2X=34 和 2n=4X=68 的混倍体。然而，我国引进和自主选育的三角梅种质资源已达上千个，绝大多数三角梅种质资源染色体的倍性尚未明确，这使三角梅育性研究、倍性育种和杂交育种等工作受到限制，同时也影响到三角梅育种方法的选择。厦门市园林植物园建有国家三角梅种质资源库，收集保存三角梅活体种质资源 600 余份，品种 320 多个。为开展三角梅倍性育种和杂交育种工作，有必要对三角梅种质资源染色体倍性进行鉴定。染色体倍性鉴定的方法有多种，如染色体观察法、形态观察法。染色体观察法虽然准确性高，但操作复杂、技术难度大、工作量较大2425，而形态观察法的准确性比染色体观察法低得多26。近年来，流式细胞术成为植物染色体倍性鉴定、基因组大小测定等的重要工具27。流式细胞术可对处于液流中各种荧光标记的微粒进行多参数快速准确地定性和定量分析28。由于该方法具有快速、灵敏且可同时进行染色体倍性鉴定和基因组大小估测等优点而被广泛应用2930，已成功用于茉莉花(Jasminum sambac)31、杏(Prunus armeniaca)32、兰 属(Cymbidium)33、香 蕉(Musa nana)34、文 心 兰(Oncidium hybridum)35、桑树(Morus alba)36等多种植物染色体的倍性鉴定。本研究采用流式细胞术鉴定 54 份国内外引进的三角梅种质资源及 14 份实生种质的基因组大小和染色体倍性，为开展三角梅种质创新、倍性育种等研究提供参考。1 材料与方法 1.1 材料 供试材料含 54 份从国内外收集的三角梅种质资源和 14 份实生种子苗，均种植于厦门市园林植物园国家三角梅种质资源库三角梅资源圃，管理措施和栽培环境基本一致。对照品种为二倍体福尔摩莎。内参为番茄(Solanum lycopersicum)，内参基因组大小约 900 Mbp，以番茄种子萌发后 1 个月的幼苗嫩叶为实验材料，番茄种子由中国科学院昆明植物研究所提供。流式细胞仪(型号BD FACScalibur)由美国 Becton Dickinson 公司生产。1.2 方法 1.2.1 细胞悬浮液制备细胞悬浮液制备 采集各种质嫩叶，参考田新民等28的方法配制MGb解离液，参考李春牛等31的方法制备细胞悬浮液。1.2.2 流式细胞仪检测流式细胞仪检测 参考李春牛等31的方法，利用流式细胞仪对染色后的细胞核悬浮液样品进行上机检测。1.2.3 计算基因组大小和染色体倍性计算基因组大小和染色体倍性 参考田新民等28、李春牛等31的方法，计算待测样品基因组大小和染色体倍性。1.3 数据处理 采用 Modifit3.0 软件对数据进行分析并制图。2 结果与分析 2.1 流式细胞法倍性鉴定可行性 采用内参法对待测样品与内参样品同时进行第 6 期 陈宜木等：利用流式细胞术鉴定 68 份三角梅基因组大小与染色体倍性 419检测，由此测定三角梅 DNA 含量。结果显示内参与二倍体美露、三倍体狂欢节、四倍体蒙杜林待测样品的峰值能完全分开，并且没有重叠峰，峰型也较清晰集中(图 1)。由此表明，选用番茄为内参测定三角梅 DNA 含量是可行的。图 1 三种倍性三角梅的 FCM 测定分析 Fig.1 Histogram of cell peak values of three kinds of ploidy bougainvillea A.二倍体；B.三倍体；C.四倍体 2.2 三角梅种质资源的染色体倍性分析 对从国内外收集的 54 份三角梅资源的 DNA含量进行测定，根据内参和待测样品的荧光强度(表 1)，计算出待测样品的基因组为 2.485.12 Gb，其中，对照品种二倍体福尔摩莎的基因组为2.66 Gb。根据待检测资源的基因组大小与对照品种的基因组大小的关系，计算待检测三角梅的染色体倍性。结果表明，所收集到的 54 份三角梅资源中有 表 1 收集的三角梅种质资源的基因组大小及倍性 Table 1 Genome size and ploidy of collected germplasm of Bougainvillea 品种(种质)内参荧光强度 待测样品荧光强度 基因组大小/Gb 倍性 福尔摩莎 18.16 54.82 2.66 2X 蓝月亮 18.33 55.74 2.68 2X 美露 18.29 56.21 2.70 2X 瓦基德阿里莎(变异)18.03 79.81 3.90 3X 比拉斯 18.35 54.74 2.63 2X 狂欢节 18.77 84.06 3.94 3X 斯嘉丽奥哈拉 19.17 58.52 2.69 2X 大花安格斯 19.56 58.35 2.63 2X 约瑟芬艾丽西亚 20.01 61.51 2.71 2X 红芽大红 19.61 89.20 4.00 3X 路易斯沃顿 19.66 88.63 3.97 3X 三角洲黎明 19.90 56.15 2.48 2X 金心橙 19.94 56.42 2.49 2X 拉斐泰 20.49 85.22 3.66 3X 赛玛莎蒙 20.31 58.63 2.54 2X 玫瑰红 19.54 56.55 2.55 2X 皇家多芬 19.32 54.71 2.49 2X 第 51 卷 420续表 品种(种质)内参荧光强度 待测样品荧光强度 基因组大小/Gb 倍性 苏雷卡 19.60 81.84 3.67 3X 奇叶大红 19.79 86.11 3.83 3X 传奇 19.