六价铬致肝脏损伤作用机制的生物信息学分析_王睿.pdf

第 49 卷 第 2 期2023年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.2Mar.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230221六价铬致肝脏损伤作用机制的生物信息学分析王睿1,章鼎2,诸葛瑞剑1,薛倩1,郭丽1（1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学中日联谊医院脊柱外科，吉林 长春 130033）摘要 目的目的：通过生物信息学方法识别六价铬 Cr（）致 肝 脏 损 伤 的 相 关 基 因，为探讨Cr（）致机体肝脏损伤作用机制的研究提供新的方向。方法方法：检索基因表达综合（GEO）数据库中与“Cr（）liver”相关数据集，下载数据集 GSE65198，通过 limma 包筛选差异表达基因（DEGs），并进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，采用 String数据库进行蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析，Cytohubba插件筛选 hub基因，通过 Enrichr网站使用药物特征数据库预测靶向药物分子。结果结果：选择数据集 GSE65198 中的样本 20 例，分为 2 组。第 1组 20 mg kg1 Cr（）1次暴 露 后 1 d 肝 脏 样 本 和 对 照 样 本各 5例；第 2组 20 mg kg1 Cr（）1次暴露后 7 d肝脏样本和对照样本各 5例，以每组的对照样本作 为 阴 性 对 照 分 别 筛 选 得 到 342个和61个 DEGs（|Log2 FC|1和 P1 and P0.05）.The GO enrichment analysis results showed that the DEGs were mainly enriched in the biological processes such as the drug response，mitosis，senescence and so on；the KEGG analysis results showed that the main signaling pathways included the ribosome biogenesis，cell cycle regulation，and p53 signaling pathway and so on.The hub gene analysis results in the PPI network showed that the EBNA1 binding protein 2（EBNA1BP2），nucleolar protein 58（NOP58），guanine nucleotide binding protein like 3（GNL3），nucleolar protein 56（NOP56），and WD repeat domain 12（WDR12）in 1 d group after single exposure and cyclin B2（CCNB2）（the identifier in PPI network was ENSRNOP00000017117），cyclin A2（CCNA2）cyclin B1（CCNB1），cyclin dependent kinase 1（CDK1），and kinesin family member 20B（KIF20B）in 7 d group after single exposure were screened as the hub genes.The targeted drug prediction results showed that roscovetine and other drugs were identified as the targeted drugs for liver injury by induced Cr（）.Conclusion：The mechanism of liver injury induced by Cr（）may be related to cell cycle regulation-related genes，and roscovitine may be the potential clinical treatment drug.KEYWORDS Hexavalent chromium；Liver；Bioinformatics；Differentially expressed genes；Injury六价铬 hexavalent chromium，Cr（）是环境中常见的重金属污染物，常以铬酸根离子的形式存在，具有较强的氧化活性和化学毒性1。在生产生活中，Cr（）可通过呼吸系统、消化系统和皮肤接触进入人体，对肝脏、肾脏、心脏和脾脏等器官造成急慢性损害1-2。Cr（）经口暴露后，在机体内发挥主要毒作用及生物代谢作用的靶器官是肝脏1。目前关于 Cr（）致肝脏损伤的毒作用机制包括：经 Cr（）暴露的肝组织中出现炎细胞浸润3；Cr（）会导致肝细胞内稳态失衡，引发氧化应激反应，还原过程中会产生过渡价态铬和活性氧（active oxygen，ROS）4，还原产物还会与 DNA 结合形成 Cr-DNA 加合物5，导致 DNA 损伤或染色体畸变6；Cr（）进入肝细胞会破坏线粒体膜结构，使线粒体功能受损，过量 ROS 蓄积影响能 量 代 谢 诱 导 肝 细 胞 凋 亡7；Cr（）会引起肝细胞外钙离子内流，钙离子超载会影响细胞对损伤的敏感性，进一步导致细胞凋亡和坏死8；低浓度 Cr（）暴露会引起肝细胞 DNA 合成期阻滞，高浓度则会引起 DNA 合成后期和分裂期阻滞9；Cr（）也可以通过内质网应激途径诱导肝细胞凋亡10。但是 Cr（）致肝脏损伤的毒作用机制尚未完全阐明。以往对于Cr（）致肝脏损伤机制的研究缺乏对生物信息学的整合和对关键通路的识别，且目前国内外也缺少生物信息学方面报道，全面系统地研究基因表达谱的变化有助于更好地阐明 Cr（）致肝脏损伤的潜在分子机制。本研究利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库11的高通量测 序 数 据 GSE65198，筛 选 差 异 表 达 基 因（differentially expressed genes，DEGs），进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析12，构建蛋白-蛋白 互 作（protein-protein interaction，PPI）网 络，筛选 hub 基 因 以 及 预 测 靶 向 药 物 分 子，识别Cr（）致肝脏损伤的相关基因，为进一步探讨Cr（）致机体肝脏损伤的作用机制提供基础。1 材料与方法 1.1数据收集和标准化数据收集和标准化使用的分析数据来自GEO 数 据 库（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据集 GSE6519813，种属为大鼠。数据集453第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）GSE65198 共 有 59 例 样 本，该 原 始 数 据 已 通 过Partek GS 6.6 中的主成分分析检查了微阵列数据是 否 存 在 异 常，并 采 用 Robust Multi-Array Averaging 算法进行了背景调整、规范化和总结。选择其中20例样本分为2组，第 1 组肝脏 20 mg kg1 Cr（）1次暴露后 1 d和对照样本各 5例，第 2组肝脏 20 mg kg1 Cr（）1 次暴露后 7 d 与对照样本各 5例。1.2DEGs 的识别和分析的识别和分析将每组中的对照样本作为阴性对照组，暴露样本为实验组，采用 R语言（version 4.0.2）中 的 limma 包（version 3.44.3）进行差异分析，贝叶斯方法建立线性模型，采用t 检验和方差分析进行统计学分析，以 P1且 P0.05。再 利 用 R 语 言 的 pheatmap（version 1.0.12）和 ggplot2（version 3.3.2）包分析 DEGs并可视化，绘制热图和火山图。1.3富集分析富集分析将获得的暴露后 1 d 组和 7 d 组的DEGs 上 传 至 DAVID 2021（https：/david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行 GO 富集分析和 KEGG信号通路富集分析。Fisher 精 确 概 率 法 检 验 得 出P值，以 P0.05为差异有统计学意义。1.4PPI 网络构建和网络构建和 hub 基因筛选基因筛选在 STRING 11.5（https：/cn.string-db.org/）14中分别构建暴露后 1 d组、7 d组和暴露后 1 d组及 7 d组均表达的 DEGs 的 PPI 网络图，设置置信度为 0.400 进行筛 选，以 P1 且P0.05）。图 1 A 和 1B 分别为 1 次暴露后 1 d 组和1次暴露后 7 d组 DEGs的热图，图 1C 和 1D 分别是1 次暴露后 1 d 组和 1 次暴露后 7 d 组 DEGs 的火山图。其中天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）、细胞周期蛋白 B2（cyclin B2，CCNB2）、细胞分裂周期 20（cell division cycle 20，CDC20）、细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 抑 制 剂 3（cyclin dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）、CXC 基序趋 化 因 子 配 体（C-X-Cmotif chemokine ligand 1，CXCL1）、脂 肪 酸 结 合 蛋 白 4（fatty acid binding protein 4，FABP4）、动 粒 定 位 Astrin 结 合 蛋 白（kinetochore localized Astrin binding protein，KNSTRN）、LOC100912602、金 属 硫 蛋 白 2A（metallothionein 2A，MT2A）、PQ 循环重复包含蛋 白 3（PQ cycle repeats contain protein 3，PQLC3）、RT1 Ib 类 基因座 EC2（RT1-EC2）和生长抑素受体 3（somatostatin receptor 3，SSTR3）是 2 组中均存在 DEGs，共同影响糖皮质激素反应的生物学过程，均参与了卵母细胞减数分裂和细胞周期的信号通路。2.2GO 富集分析和富集分析和 KEGG 通路分析通路分析对 DEGs进行 GO 富集分析，GO 包括生物过程、分子功能和细胞成分3个注释内容。Cr（）1次暴露后1 d组DEGs最显著的生物学过程包括药品反应、异种生物刺激反应和衰老等；Cr（）1 次暴露后 7 d 组最显著的生物学过程包括有丝细胞分裂、有丝分裂纺 锤 体 中 间 区 组 合 和 细 胞 分 裂 的 正 向 调 节 等。KEGG 通路分析结果显示：Cr（）1次暴露后1 d组DEGs 参与了代谢、真核生物中的核糖体生物发生、细胞色素 P450 对异生素的代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信号通路等信号通路；Cr（）1 次暴露后 7 d 组DEGs参与了孕酮介导的卵母细胞成熟、细胞周期调节、细胞衰老、卵母细胞减数分裂和 p53信号通路等信号通路。2.3 PPI 网 络 构 建 和网 络 构 建 和 hub 基 因 筛 选基 因 筛 选 基 于STRING 数据库分析 DEGs