一测多评法测定黑果小檗果实中5种花色苷含量_陈玲.pdf

化学试剂 第 卷第 期一测多评法测定黑果小檗果实中 种花色苷含量陈玲，包海燕，阳莹，李敏，李慧敏，康莹莹，李建光，（新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐；新疆科技学院 医学院，新疆 库尔勒）摘要：建立高效液相色谱一测多评法（）测定黑果小檗果实中 种花色苷的含量。采用 色谱柱（.，）；流动相为甲醇.甲酸水溶液，梯度洗脱；检测波长为 ；流速为.；柱温为 ；进样量为 。以矢车菊素 葡萄糖苷为内参物，建立飞燕草素葡萄糖苷、矮牵牛素葡萄糖苷、芍药素葡萄糖苷以及锦葵素葡萄糖苷的相对校正因子，并计算各成分含量，同时与外标法测定结果进行对比。种花色苷分别在各自浓度范围内与峰面积的线性关系良好（.）；平均加样回收率为.，为.；批不同产地的黑果小檗采用 法与外标法所测含量无显著性差异（.）。该方法可用于黑果小檗果实中 种花色苷的含量测定。关键词：黑果小檗；花色苷；一测多评法；相对校正因子；含量测定中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，）：（）（.，）.，.，（.）；.（.）：；收稿日期：；网络首发日期：基金项目：杰出青年科学基金项目（）；新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室项目（）。作者简介：陈玲（），女，浙江台州人，硕士生，主要研究方向为天然药物资源的研究与开发。通讯作者：李建光，：。引用本文：陈玲，包海燕，阳莹，等一测多评法测定黑果小檗果实中 种花色苷含量 化学试剂，（）：。黑果小檗（）为小檗科小檗属灌木植物，始载于新疆中草药手册，在新疆阿勒泰及天山等地区均有分布，因果实成熟后呈紫黑色而得名。该果实具健胃和中、生津止渴、清热解毒等功效，哈萨克族人民会将果实长期泡茶饮用，具有降血压的作用。近年研究发现黑果小檗果实中主要有 种花色苷，分别为飞燕草素葡萄糖苷（，）、矢车菊素 葡萄糖苷（，）、矮 牵 牛 素葡 萄 糖 苷（，）、芍药素葡萄糖苷（，）、锦葵素葡 萄 糖 苷（，）。药理学研究发现，花色苷在抗炎、抗氧化、抗癌、保护心血管以及调节血脂等方面都有显著的疗效，并对 型糖尿病、阿尔兹海默病以及肝纤维化等疾病的防治表现出巨大的潜力。第 卷第 期陈玲等：一测多评法测定黑果小檗果实中 种花色苷含量目前常用 示差法和高效液相外标法对花色苷进行含量测定，然而 示差法仅用于总花色苷的含量测定且准确度较低，采用外标法可同时测定多个花色苷的含量，但存在操作繁琐复杂以及对照品价格昂贵等缺点，因而亟需一种高效快捷、低成本的含量测定方法。一测多评法（，）利用中药各成分存在内在函数关系，建立成分间的相对校正因子，以其中一个性质稳定、廉价易得的成分为内参物，实现多成分的同步定量。该方法不仅降低了检测的成本，解决对照品不足及不稳定的问题，而且缩短了检测的时间，提高了方法的实用性。本研究选择价格便宜、易得的 为内参物，建立 法同时测定黑果小檗果实中 种花色苷含量，以期实现以单指标对黑果小檗果实进行多指标成分含量测定的目的。实验部分.主要仪器与试剂 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；型分析天平（瑞士梅特勒公司）；型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；型 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。（纯度.）、（纯度.）、（纯度.）、（纯 度.）、（纯度.）（成都麦德生科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国 公司）；甲酸（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；实验用水为超纯水。批黑果小檗果实分别采自新疆不同地区，经新疆医科大学药学院生药学教研室胡君萍教授鉴定为小檗科小檗属黑果小檗（）的果实，样品信息见表。表 样品信息 编号产地采收日期新疆伊犁 年 月新疆伊犁 年 月新疆博乐 年 月新疆阿勒泰 年 月新疆南山 年 月新疆塔城 年 月.实验方法.色谱条件色谱柱：（.，）；流动相：甲醇（）.甲酸水（），梯度洗脱（，；，；，；，；，；，）；检测波长：；流速：.；柱温：；进样量：。.混合对照品储备液的制备分 别 取、对照品适量，精密称定，置于 棕色容量瓶中，用 甲醇（含体积分数.的）稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为.、.、.、.、.的混合对照品储备液。.混合对照品溶液的制备精密量取 混合对照品储备液，用 甲醇（含体积分数.的）定容至 ，摇匀，制成浓度分别为.、.、.、.、.的混合对照品溶液。.供试品溶液的制备取约.黑果小檗粉末，精密称定，置于 具塞锥形瓶中，精密加入 甲醇（含体积分数.的），摇匀，称定质量，室温超声 ，放冷后再称定质量，用 甲醇（含体积分数.的）补足质量，摇匀，过滤，为样品储备液。取 样品储备液定容至，用.微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。结果与讨论.方法学考察.系统适用性试验精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各，按.色谱条件进样测定，发现各目标峰峰形良好，与相邻峰的分离度.，理论塔板数大于 ，色谱图见图。.线性关系考察精密吸取.、.、.、.、.、.混合对照品储备液，分别置于 棕色容量瓶中，用 甲醇（含体积分数.的）稀释至刻度，摇匀，按.色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（，）、峰面积为纵坐标（）进行线性回归，化学试剂 第 卷第 期 混合对照品色谱图；供试品色谱图；图 对照品及供试品 图 结果表明 种花色苷在各自范围内线性关系良好。另取.混合对照品溶液，用 甲醇（含体积分数.的）进行倍比稀释，分别以 倍信噪比和 倍信噪比考察检测限和定量限，结果见表。表 线性方程、线性范围与定量限、检测限结果 ，成分线性方程线性范围（）检测限定量限 .精密度试验精密吸取 .混合对照品溶液，按.色谱条件连续进样 次，记录峰面积并计算其。结果、峰面积的 分别为.、.、.、.、.（），表明仪器精密度良好。.稳定性试验精密吸取 同一份供试品溶液，分别在、时按.色谱条件进样测定，记录峰面积并计算其。结果、峰面积的 分别为.、.、.、.、.（），表明供试品溶液在 内稳定性良好。.重复性试验取约.黑果小檗粉末（），精密称定，按.方法制备 份供试品溶液，按.色谱条件进样测定，记录峰面积，计算 种成分的含量及其。结果、平均含量分别为.、.、.、.、.，分别为.、.、.、.、.（），表明该方法重复性良好。.回收率试验取约.已知含量黑果小檗粉末（），精密称定，按.方法制备 份供试品溶液，按、的比例精密加入 种花色苷对照品溶液，按.色谱条件进样测定，记录峰面积，计算 种花色苷平均加样回收率及，结果 均小于，表明该方法准确度良好，结果见表。表 样品回收率试验结果 （）成分已知量加入量测得量加样回收率 平均加样回收率.第 卷第 期陈玲等：一测多评法测定黑果小檗果实中 种花色苷含量续表成分已知量加入量测得量加样回收率 平均加样回收率.相对校正因子（）的确定分别精密吸取、.混合对照品溶液，按.色谱条件进样测定，记录峰面积，采用多点校正法，根据公式 （）（其中 为待测成分与内参物的相对校正因子，为内参物峰面积，为内参物浓度，为待测组分峰面积，为待测组分浓度），以 为内参物，计算、的相对校正因子，结果见表。表 各成分相对校正因子 进样体积（内参物为）.均值.耐用性考察.不同仪器、色谱柱的影响分别考察岛津、这两种色谱仪和 （.，）、（.，）以及依利特 （.，）这 种色谱柱对 的影响，并计算，结果 均小于，表明建立的 在不同色谱仪和色谱柱重现性良好，结果见表。表 不同仪器和色谱柱的相对校正因子 色谱仪色谱柱（内参物为）岛津 依利特 .依利特 .均值.不同流速、柱温、波长、流动相 值的影响采用岛津 型色谱仪、色谱柱（.，）分别考察不同流速（.、.、.、.、.）、柱温（、）、波长（、）、流动相（、.、.、甲酸溶液）值对 的影响，并计算，结果 均小于，表明建立的 在不同实验条件下的耐用性良好，结果见表。表 不同流速对相对校正因子的影响 流速（）（内参物为）.均值.表 不同柱温对相对校正因子的影响 柱温（内参物为）.均值.化学试剂 第 卷第 期表 不同波长对相对校正因子的影响 波长（内参物为）.均值.表 不同流动相 值对相对校正因子的影响 流动相 值（内参物为）甲酸（.）.甲酸（.）.甲酸（.）.甲酸（.）.甲酸（.）.均值.待测成分色谱峰定位相对保留时间法是目前最常用的色谱峰定性方法，本研究在岛津、两种色谱仪上分别用 种不同色谱柱考察了各待测色谱峰相对保留时间的重现性。由表 可知，保留时间靠前的色谱峰，其实测和预测保留时间的相对误差（，）绝对值相对较小，定位较准确，可采用相对保留时间法定位；但保留时间靠后的、色谱峰的误差偏大，部分保留时间甚至相差 以上，难以准确定位。王龙星等提出在同样分析条件下，不同的色谱仪和色谱柱，各成分的保留时间存在简单的线性关系。本研究采用原理近似的“两点校正法”定位色谱峰，为保证计算结果的准确性，在前后色谱峰各选 点，以内参物 和最后一个色谱峰 为对象进行两点校正，岛津 测定的两者保留时间为横坐标（），其他色谱仪和色谱柱测定的保留时间为纵坐标（）建立校正方程，再将岛津 分离各成分的保留时间代入方程，进行相应色谱峰定位。由表 可知，采用两点校正法除 的差异较大以外，其余成分保留时间的实测和预测 绝对值均小于，可准确定位色谱峰。对于，由于其出峰靠前，可单独采用相对保留时间法定位。.外标法与 法结果比较精密称定 批黑果小檗，按.方法制备 份供试品溶液，每批平行 份，按.色谱条件进样测定，记录峰面积，分别以外标法和 法计算各成分含量，结果见表，采用 .软件，对外标法和 法测得的结果进行统计学分析，结果显示.，表明两种方法测定值之间无显著差异。表 相对保留时间预测保留时间定位色谱峰 色谱仪色谱柱保留时间岛津 标准保留时间（）标准相对保留时间间（，）.实测 预测（.）实测 与预测 的.依利特 实测 预测（.）实测 与预测 的.实测 预测（.）实测 与预测 的.实测 预测（.）实测 与预测 的.依利特 实测 预测（.）实测 与预测 的.第 卷第 期陈玲等：一测多评法测定黑果小檗果实中 种花色苷含量表 两点校正法预测出峰时间定位色谱峰 色谱仪色谱柱保留时间岛津 标准保留时间（）.实测 预测（.）实测 与预测 的.依利特 实测 预测（.）实测 与预测 的.实测 预测（.）实测 与预测 的.实测 预测（.）实测 与预测 的.依利特 实测 预测（.）实测 与预测 的.表 种成分含量测定结果 （，）编号外标法外标法外标法外标法外标法.讨论.内参物的选择 作为主要活性成分之一，具有价格便宜、在样品中含量高、性质稳定等特点，适宜在长期大量分析实验中使用，因此本研究以 为内参物，建立一测多评的分析方法，弥补了对照品不足或价格昂贵等缺点，也体现了 法低成本的优势。.供试品制备方法本研究的前处理方法基于课题组前期研究，以 甲醇（含体积分数.的）为提取溶剂，室温超声 ，料液比（），提取 次作为前处理方法，。该方法能够兼顾上述 种成分，峰形良好，杂质干扰峰较少。.色谱条件的选择以黑果小檗果实中 种花色苷的分离效果为主要考察指标，兼顾分析检测用时、色谱图基线平稳等因素，结果发现甲醇.甲酸水溶液梯度洗脱分离效果较好，其中 和 达不到有效分离，进而对、柱温进行了考察，根据其对分离效果的影响及对色谱柱寿命的影响，选择柱温为 ，能够实现各成分有效分离。最终确定以.中梯度洗脱程序对黑果小檗果实 种花色苷含量同时进行检测。结果在此条件下，各成分分离效果较好，色谱图基线平稳，杂质对目标成分的测定干扰较小。.耐用性考察本研究考察了不同色谱仪、色谱柱、流速、柱温、波长以及流动相 对 的影响，结果表明实验条件的改变对 的影响较小，体现 法在黑果小檗含量测定中有良好的技术应用性和方法重现性。.色谱峰定位 法能够实现多指标同步定量的关键是对于各成分色谱峰的准确定位。相对保留时间法虽然是 法中最常用的色谱峰定性方法，但化学试剂 第 卷第 期由于色谱柱和色谱仪的差异，其预测结果与实际结果存在较大差异，只适合保留时间靠前的色谱峰，在实际应用中准确性不强。根据相关文献在色谱峰定位方法选择上研究，发现两点校正法优于相对保留时间定位法。本研究采用两点校正法，通过绘制校正曲线，推算理论出峰时间，从而实现对色谱峰准确