一株发酵乳糖不产气大肠埃希氏菌的分离与鉴定_刘腊兰.pdf

刘腊兰等：一株发酵乳糖不产气大肠埃希氏菌的分离与鉴定7-生物技术 遗传育种湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）引用格式：刘腊兰，刘子音，卓一鸣，等.一株发酵乳糖不产气大肠埃希氏菌的分离与鉴定 J.湖南农业科学，2023（2）：7-11.DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.002.0022023（2）：7-11大肠埃希氏菌（Escherichia coli）能够在 44.5发酵乳糖产酸产气，IMViC 试验（鉴定肠杆菌科细菌的一组生化试验的简称，包括吲哚、甲基红、伏-波二氏和柠檬酸盐 4 种试验）显示其为革兰氏阴性无芽孢杆菌1，普遍存在于人和动物肠道中，并随宿主粪便排至环境中，可作为判断水或食品有无被粪便污染的卫生指标菌2-3。正常情况下，大肠埃希氏菌对宿主不致病，当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道以外部位时，可引起感染者产生腹泻、腹痛，严重者甚至引起菌血症、败血症、肺炎、脑膜炎等临床症状4。可致感染者产生以腹泻为主要症状的大肠埃希氏菌被称为致泻大肠埃希氏菌（Diarrhe-ogenic Escherichia coli，DEC）5。20122015 年我国 21 个省报告的 46 721 例腹泻检测病例中 DEC 总检出率为 7.7%，20152019 年北京市采集的 27 619例腹泻病例中 DEC 检出率达 9%，20182019 年江苏省收集的 24 292 例食源性疾病患者中 DEC 检出率达2.48%6-8。此外，大肠埃希氏菌作为条件致病菌，易引发泌尿道、呼吸道等部位的感染，是临床感染中最为常见的病原菌之一9-10。由此可知，大肠埃希氏菌感染的防控需引起重视。根据食品安全国家标准 GB 4789.382012，大肠埃希氏菌在 44.5条件下培养能分解 EC 肉汤中的乳糖产酸产气。而大肠埃希氏菌作为大肠菌群的代表菌，按食品安全国家标准 GB 4789.32016、GB 149342016 检验，该菌在 36条件下培养能分解月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）及煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）中的乳糖产酸产气。此前，笔者 一株发酵乳糖不产气大肠埃希氏菌的分离与鉴定 刘腊兰，刘子音，卓一鸣，彭纳，吴后吕（长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410006）摘要：为了准确鉴定 1 株分离自餐饮具的大肠埃希氏菌非典型菌株（发酵乳糖不产气），通过传统分离培养、常规生化试验、微生物鉴定、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、多重聚合酶链式反应（multi-PCR）的方法对该菌株进行联合鉴定。结果表明：该菌株乳糖发酵试验及伊红美蓝琼脂（EMB）平板上的菌落形态均有别于典型大肠埃希氏菌，但微生物鉴定、MALDI-TOF MS、多重 PCR 鉴定结果与标准菌株一致，均显示为大肠埃希氏菌。这说明常规方法检验非典型大肠埃希氏菌有误判风险，建议检验者遇初发酵培养物变浑浊时转接 EMB 琼脂平板，并辅以微生物自动鉴定仪器或分子生物学方法对可疑菌落进行鉴定，以确保检验结果的准确性。关键词：大肠埃希氏菌；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；多重聚合酶链式反应中图分类号：Q93-335文献标识码：A文章编号：1006-060X（2023）02-0007-05Isolation and Identification of an Escherichia coli Strain Fermenting Lactose Without Gas Production LIU La-lan，LIU Zi-yin，ZHUO Yi-ming，PENG Na，WU Hou-lyu（Changsha Institute for Food and Drug Control,Changsha 410006,PRC）Abstract：To accurately identify an atypical Escherichia coli(fermenting lactose without gas production)from catering utensils,traditional isolation and culture,routine biochemical experiments,microbial identification system,matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS),and multiple polymerase chain reaction(multi-PCR)have been jointly used.The results of lactose fermentation experiment and colony morphology of the anaerogenic strain on the eosin-methylene blue agar(EMB)plate have showed its difference from the typical Escherichia coli;however,the results of microbial identification system,MALDI-TOF MS and multi-PCR have consistently confirmed that it is an Escherichia coli.That means the routine method for inspecting atypical Escherichia coli has a risk of misidentification.It is recommended to transfer the primary fermentation culture substance to EMB agar plates when it is becoming turbid,and to supplement the automatic identification system or molecular biology method for the identification of suspicious colonies,ensuring the accuracy of inspection results.Key words：Escherichia coli;MALDI-TOF MS;multi-PCR收稿日期：2022-09-28基金项目：国家市场监督管理总局科技计划项目（2020MK074）作者简介：刘腊兰（1989），女，湖南安乡县人，工程师，主要从事食品药品微生物检验工作。通信作者：刘子音湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 2 月8-生物技术 遗传育种在进行一批餐饮具的大肠菌群检测时，分离到 1 株发酵乳糖产酸但不产气的菌株，其在伊红美蓝（EMB）琼脂平板上呈现大肠埃希氏菌可疑菌落形态，常规生化结果符合大肠埃希氏菌生化特征，将该菌株经过 3 次营养琼脂纯化复苏后，转接 LST、BGLB、EC 肉汤培养基培养后仍然发酵乳糖不产气。而后笔者对该菌株进行了微生物鉴定、蛋白图谱鉴定及核酸检测，结果均显示为大肠埃希氏菌。对该菌进行生化分型显示，该菌属于大肠埃希氏菌发碱-殊异株生化类型，是一类特殊生化型的大肠埃希氏菌。2012 年，姚欣等11就报道过在临床上发现发碱-殊异株大肠埃希氏菌。而笔者这是首次在食品检验工作中发现大肠埃希氏菌发碱-殊异株。该研究针对该类菌株提出可行的分离与鉴定方法，旨在为食品中生化非典型大肠埃希氏菌的检验提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）标准菌株 ATCC25922、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC8739、肠道出血性大肠埃希氏菌（Enterohemorr-hagic Escherichia coli，EHEC）ATCC43889，均由美国典型菌种保藏中心提供。肠道致病性大肠埃希氏菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）CICC 24189、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）CICC24188、产肠毒素大肠埃 希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）CICC 10667、肠道集聚性大肠埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）CICC24186，均由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。样本菌株从餐饮具样品中分离，磁珠-70保存。1.1.2培养基及试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）、EC 肉汤、营养琼脂、伊红美蓝（EMB）琼脂培养基、脑心浸出液肉汤（BHI）5 种致泻大肠埃希氏菌多重 PCR 检测试剂盒及生化管（北京陆桥技术股份有限公司）；API20E 肠杆菌和其他革兰阴性杆菌鉴定试剂条（生物梅里埃法国股份有限公司）。1.1.3主要仪器设备LRH-250F 培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），BIOMIC V3 微生物鉴定与药敏分析仪（美国 Giles Scientific 公司），梅里埃基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS，生物梅里埃中国有限公司），S1000 梯度 PCR仪（美国伯乐 Bio-rad 公司），DYY-6C 电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1样本菌株分离将发酵乳糖产酸不产气的餐饮具 LST 培养物划线接种至 EMB 琼脂平板，36培养 24 h 后观察结果；然后挑取 EMB 琼脂平板上的可疑菌落至营养琼脂平板，36培养 24 h。1.2.2常规生化鉴定挑取上述营养琼脂平板上的单个菌落，接种至靛基质（I）、甲基红（M）、乙二酰试验（VP）、柠檬酸盐（C）生化管，36培养 24 h 后观察结果，进行 IMViC 试验。1.2.3产气试验挑取营养琼脂平板上的单个菌落再次转接至营养琼脂平板，36培养 24 h。在经过 3次复苏培养后，挑取单个菌落分别接种 LST、BGLB肉汤置于 36，同时接种 EC 肉汤置于 44.5，均培养 48 h 后，观察结果。1.2.4自动生化鉴定仪鉴定挑取复苏培养后的菌落至 0.85%生理盐水中，制备成约 0.5 麦氏浊度的菌悬液，逐一滴加菌悬液至 API20E 生化鉴定条的每个生化管孔，36培养 24 h 后，将鉴定条放置BIOMIC V3 微生物鉴定与药敏分析仪器卡槽中进行结果判读。1.2.5蛋白图谱鉴定挑取质控菌株大肠埃希氏菌ATCC8739 单个菌落均匀涂布至靶板校准位点，标准菌株及分离菌株经复苏培养后的单个菌落至检测位点，每个位点加 1 L 基质液进行裂解，待自然晾干后经梅里埃基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）进行蛋白图谱鉴定。1.2.6核酸检测转接复苏培养后的菌落至 BHI 肉汤，同时分别接种大肠埃希氏菌标准菌株、肠道致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和肠道集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）至 BHI 肉汤，36培养 24 h 后，提取 DNA 模板。然后，按 5 种致泻大肠埃希氏菌多重 PCR 检测试剂盒说明书进行 PCR 扩增。反应体系如下：2 L DNA 模板，23 L PCR Buffer，总体积 25 L。扩增程序：95预变性 5 min；95变性 30 s，63复性 30 s，72延伸 1.5 min，变性至延伸步骤循环 40 次；72终止 10 min。以 5 种致泻大肠埃希