一株市场来源cfr阳性金黄...球菌的分离鉴定及耐药性分析_赵泽广.pdf

20 xperimental study on onlineE实验研究一株市场来源 cfr 阳性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析赵泽广1,2，李杰峰2，张 宁2，杨 威2，赵志强2，孙艳玲3，徐志媛1,2，李 琴1（1.河北工程大学 生命科学与食品工程学院 056038；2.河北省畜牧兽医研究所 071000；3.河北农业大学动物医学院 071000）摘要：为了解保定市市场生鲜肉中金黄色葡萄球菌多重耐药菌株的生物学特性。本文对保定市场生鲜肉中分离的一株携带耐药基因 cfr 的金黄色葡萄球菌生化特性和耐药性进行分析。试验通过细菌分离、血浆凝固酶试验、生化试验，得到一株金黄色葡萄球菌，并对其进行药敏试验和耐药基因检测。药敏试验结果显示分离菌株对万古霉素和利奈唑胺敏感，对头孢曲松钠、左氧氟沙星、卡那霉素中介，对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、林可霉素、阿奇霉素、环丙沙星耐药，并检测出 cfr 和tetM 耐药基因，该分离菌表现出多重耐药性。本研究为保定市售生鲜肉金黄色葡萄球菌污染风险评估和临床治疗用药提供数据支撑。关键词：金黄色葡萄球菌；分离鉴定；cfr；耐药性；耐药基因金黄色葡萄球菌是自然界中常见的一种致病菌，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性，可以引起严重感染1-2。近年来，金黄色葡萄球菌污染问题已经成为了世界范围内影响公共卫生与人类和动物健康的重大问题。欧盟一些国家中由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒事件占食源性疾病事件的5%3-4。我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第 4 位。随着抗生素种类越来越多，使用越来越频繁，金黄色葡萄球菌的耐药性越来越严重。蔡霞5等人对 2018 年 7 月 2021 年 3月淮南市某教学医院金黄色葡萄球菌临床分布及耐药性分析，结果显示在 160 株金黄色葡萄球菌中有 69 株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。洪小兰6等在中国人民解放军联勤保障部队第 910 医院 2015 年 2019 年临床标本分离的 1750 株金黄色葡萄球菌中发现 728 株 MRSA。生鲜肉在动物屠宰、运输、储存和售卖过程中，由于操作、温度、环境等问题，金黄色葡萄球菌污染也很常见。阚浩鹏7等人在济南各类型市场的 180 份市售生鸡肉中检测到 55 株金黄色葡萄球菌。田璐8等人以中国知网 2000 年 2019 年文献为基础统计了生鲜肉微生物污染情况，结果显示我国金黄色葡萄球菌在生鲜肉中检出率为 10.81%。耐药基因 cfr 是能够介导噁唑烷酮类药物、林可酰胺类药物、截短侧耳素类药物、氯霉素类药物以及链阳菌素 A 这五大类抗菌药同时耐药的多重耐药基因9。由于 cfr 可介导恶唑烷酮类药物治疗耐药阳性菌最后一道防线，其已经成为抗生素治疗的严重威胁10。1 材料和方法1.1 材料1.1.1肉样2022 年采集的保定市售生鲜肉 23 份，其中猪肉 8 份，羊肉、牛肉 4 份，鸡肉 7 份。1.1.2主要试剂营养肉汤、7.5%氯化钠肉汤、血平板、Baird-Parker 琼脂基础、亚缔酸盐卵黄增菌液、冻干兔血浆均购自青岛海博生物技术有限公司；比浊管购自比克曼生物科技有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；快速基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；M5DL2000DNAMaker、M5DNA 电泳用琼脂糖、2M5HiPerHiFiPCRmix 均购自北京聚合美生物科技有限公司；TSA（TSB 与琼脂糖比例为 4:3）琼脂为试验室配制。1.2 方法1.2.1肉样处理 无菌采集适量肉样于 1.5mL 离心管中并加入 200L 生理盐水，使用组织研磨器将其研磨至匀浆，再加入 500L 生理盐水，振荡混匀，8000r/min 离心 5min。1.2.2细菌培养取上清液接种于 7.5%氯化钠肉汤中。37培养 24h。1.2.3细菌分离将培养的菌液接种于 Baird-Parker 平板上，37培养 24h。挑取圆形、表面光滑、凸起、湿润、大小为 2mm3mm 的具有光泽的灰黑色或黑色并伴有浅色边缘和不透明圈（沉淀）的菌落进行革兰氏染色，镜检记录菌体特征，挑选革兰氏阳性、成葡萄串状排列的球菌接种于血平板，培养24h。挑取圆形、光滑、凸起、金黄色（白色）、具有 溶血特征的菌落冻存，以备后续试验。1.2.4生化试验 将冻存的菌株复苏后接种于营养肉汤中，培养 24h。取培养物和无菌生理盐水分别接种于细菌微量生化鉴定管中，37培养 2472h，观察记录结果。1.2.5血浆凝固酶试验 取营养肉汤培养物 0.5mL 于冻干兔血浆，轻轻震荡混匀，37培养，每半个小时观察一次，观察 6h，凝固则为金黄色葡萄球菌阳性。1.2.6药敏试验 将营养肉汤培养物浓度调至1.5108CFU/mL，根据 2021 年美国临床和试验室标准化委员会标准（CLSI）进行种抗生素药敏试验，判读结果。1.2.7耐药基因检测 参照文献合成引物11-13（cfr、tetM、tetO、mecA、ermA、vanA、vanB），用分离菌培养菌液提取作者简介：赵泽广（1997-），男，汉族，学生，硕士研究生，研究方向为畜禽传染病防控*通信作者：李琴（1987-），女，讲师，研究方向为中兽医学今日畜牧兽医21DNA 进行耐药基因 PCR 扩增，扩增程序：955min，（941min，Tm1min，721min）35 循环，72终延伸 10min。扩增产物使用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。表 1 金黄色葡萄球菌耐药基因引物序列耐药基因类别基因名称引物核苷酸序列（5-3）退火温度（）产物大小（bp）多重耐药基因cfrF：TGAAGTATAAAGCAGGTTGGGAGTCAR：ACCATATAATTGACCACAAGCAGC48746大环内酯类ermAF：TCAGGAAAAGGACATTTTACCR：ATACTTTTTGTAGTCCTTCTT46423-内酰胺类mecAF:GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAR:CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA57310四环素类tetMF：GTGGACAAAGGTACAACGAGR：CGGTAAAGTTCGTCACACAC46406tetOF：AACTTAGGCATTCTGGCTCACR：TCCCACTGTTCCATATCGTCA55515万古霉素vanAF:GCTATTCAGCTGTACTCR:CAGCGGCCATCATACGG50783vanBF:CATCGCCGTCCCCGAATTTCAAAR:GATGCGGAAGATACCGTGGCT502972 结果2.1 细菌的分离培养采集保定市售生鲜肉 23 份，进行金黄色葡萄球菌分离鉴定，结果显示有 1 株从鸡肉中分离的细菌表现出金黄色葡萄球菌典型特征。分离菌在 Baird-Parker 平板上长势良好（图 1），表面凸起，光滑湿润，具有光泽，颜色黑色，同时伴有浅色边缘和不透明光圈。血平板培养基上菌落较大，表面光滑，白色，凸起并伴有 溶血环。挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检（图2），结果显示该分离菌呈葡萄串状或链状排列的圆形球菌。a b c图 1 分离菌菌落特征a：Baird-Parker 平板菌落特征，b：血平板正面菌落特征，c：血平板背面菌落特征图 2 分离菌革兰氏染色2.2 生化试验结果分离菌可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、精氨酸、尿素、淀粉，甲基红反应阳性，V-P 试验阳性，液化明胶，可在高盐肉汤中生长。表 2 生化试验结果项目结果项目结果高盐肉汤+阿拉伯醇-精氨酸+蔗糖+淀粉+甘油-尿素+葡萄糖+甘露醇-明胶+乳糖+M-R 试验+山梨醇-V-P 试验+麦芽糖+2.3 药敏试验结果药敏结果显示（表 3），该菌只对万古霉素、利奈唑胺敏感，对头孢曲松钠、左氧氟沙星、卡那霉素中介，对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、林可霉素、阿奇霉素、环丙沙星耐药，表现出多重耐药。表 3 药敏试验结果药物类型抗菌药物规格（g）判断标准结果SIR-内酰胺类氨苄西林10 17-1611（R）头孢曲松钠30 2726-27 2526（I）头孢噻肟30 2825-26 2420（R）四环素类四环素30 1915-18 146（R）林可胺类林可霉素2 1916-18 154（R）氨基糖苷类卡那霉素30 1511-14 1012（I）喹诺酮类左氧氟沙星5 2116-20 1516（I）环丙沙星5 2116-10 1514（R）大环内酯类阿奇霉素15 1814-17 138（R）糖肽类万古霉素30 1715-16 1431（S）噁唑烷酮类利奈唑胺30 21-2029（S）S:敏感，I:中介，R:耐药2.4 耐药基因检测结果2.4.1耐药基因 cfr 检测结果耐药基因 cfr 检测结果显示为阳性（图 3），目的条带为 746bp。图 3 cfr 耐药基因检测结果M：DL2000DNAMaker，泳道 1 为阳性样品。2.4.2其他耐药基因检测结果（图 4）显示，该菌株携带耐药基因 tetM，其目的条带为 406bp。22xperimental study on onlineE实验研究图 4 耐药基因检测结果M：DL2000DNAMaker,1-8：依次为 tetM、tetO、mecA、ermA、vanA、vanB。3 讨论随着我国社会的发展，食品安全已经成为了社会关注度较高的问题，金黄色葡萄球菌作为食品中第二大致病菌14，对其监测尤为重要。周勇15等对 2009 年 2018 年广州市即食食品中金黄色葡萄球菌进行检测，从 1399 份食品中分离出 157 份阳性菌株，分离率为 11.22%。2015 年秦磊16等人对唐山市 10个县区不同场所的 217 份食品进行金黄色葡萄球菌检测，阳性率为 15.2%。近年来，国内外对金黄色葡萄球菌耐药性的研究越来越多，但是对携带 cfr 耐药基因的金黄色葡萄球菌研究较少，这可能因为 cfr 耐药基因检出率较低。多数抗生素通过与细菌核糖体结合，抑制细菌蛋白质合成来达到抑菌效果17。但是，多重耐药基因 cfr 通过编码 RNA 甲基转移酶，对 23S 核糖体 RNA 的 2503 位嘌呤残基进行修饰，从而降低抗生素与细菌核糖体的肽基转移酶中心的亲和力，导致细菌对某些抗生素产生耐药性18。另外，cfr 基因是迄今为止唯一由包括质粒在内的可移动元件介导的恶唑烷酮类耐药基因19，然而恶唑烷酮类抗生素利奈唑胺作为临床上治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌和耐青霉素肺炎球菌最后一道防线20，cfr 基因可以使细菌对其产生耐药性。因此，携带 cfr 耐药基因的细菌传播对公共卫生安全形成了巨大隐患。cfr多重耐药基因陆续在包括动物源和人源的葡萄球菌、肠球菌、巨型球菌、大肠埃希氏菌和变形杆菌等革兰氏阳性和阴性菌株中均有报道21-24。尤其是在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌中更为常见18，且携带 cfr 的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床治疗的难度更大25。本研究从保定市售生鲜肉中分离到一株携带 cfr 耐药基因的金黄色葡萄球菌，但是 mecA 基因检测结果为阴性，证明该菌不是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。分离菌对 6 种抗生素表现为耐药，3 种抗生素表现为中介，出现了多重耐药的情况，但是万幸的是该菌对万古霉素和利奈唑胺敏感。其他耐药基因检测结果显示，分离菌携带有 tetM 耐药基因，药敏试验中分离菌对四环素表现出耐药，耐药表型与耐药基因检测结果一致。4 结论本试验从保定市售生鲜肉中分离得到了一株携带 cfr 耐药基因的金黄色葡萄球菌，具有严重的多重耐药性，且同时携带tetM 耐药基因，本株多重耐药金黄色葡萄球菌对生鲜肉市场公共卫生安全具有一定风险。参考文献1Liao F,Gu W,Yang Z,et al.Molecular characteristics of Staphylococcus aureus isolates from food surveillance in southwest China J.BMC Mi