两种软珊瑚EST-SSR通用性引物的研发_王沛政.pdf

第 30 卷第 2 期2023 年 4 月海南热带海洋学院学报Journal of Hainan Tropical Ocean UniversityVol 30 No 2Apr 2023收稿日期:2022 06 29基金项目:国家级大学生创新创业训练计划项目(201911100014;202011100028)第一作者:王沛政，男，陕西西安人，教授，博士，研究方向为海洋生物遗传多样性。两种软珊瑚 EST-SSR 通用性引物的研发王沛政a，b，盖如新a，b，夏利栋a，b，董娴娴a，b，郁强a，b(海南热带海洋学院 a 海南省近岸海洋生态环境过程与碳汇重点实验室;b 崖州湾创新研究院，海南 三亚，572022)摘要:基于短指软珊瑚(Sinularia ceramensis)和花环肉质软珊瑚(Sarcophyton ehrenbergi)转录组数据，比较了上述两种软珊瑚转录组 SSR 序列的差异。利用合成的 100 条 EST-SSR 引物和 4 属 11 种 30 株软珊瑚样本进行通用性筛选。研究表明，在短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚转录组数据中分别检测到 2 914 个和2 335 个微卫星，两种软珊瑚最多的重复类型均为三核苷酸序列重复，优势重复基元均为 TA/AT。筛选出 8 对扩增稳定的EST-SSR引物，Sinularia 属和 Sarcophyton 属的扩增率分别为87 50%和96 43%，Aldersladum 属的扩增率为56 25%，Lobophytum 属的扩增率为 37 50%。这 8 对种属间通用性较好的 EST-SSR 标签序列能为今后软珊瑚多样性研究提供借鉴。关键词:短指软珊瑚;花环肉质软珊瑚;转录组测序;EST-SSR;通用性中图分类号:Q953+1;Q178 53文献标识码:A文章编号:2096 3122(2023)02 0017 08DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 030引言珊瑚礁生态系统是海洋中重要、多样性高和非常具有代表性的生态系统之一1 3，在海岸线、沿岸水文动力学以及活性物质研究4 6 等领域有着重要意义。受全球范围内的气候变化、海水酸化、人为活动造成的污染以及过度开发等影响，珊瑚礁生态系统的结构和功能明显衰退7 11。软珊瑚在整个印度 西太平洋地区(包括南海、海南岛沿岸海域)都拥有较高的丰度和多样性，为大量的海洋生物提供生存、栖息和繁殖的场所12 14。微卫星(Microsatellite)，也称简单序列重复(Simple sequence repeat，SSR)，包括二至六核苷酸的串联重复，以随机的方式广泛地存在于基因组中，与其他如扩展片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性 DNA(RAPD)的显性标记，以及限制性片段长度多态性(RFLP)的共显性标记相比，表现出更高水平的多态性和更高的预期杂合度15 ，16 579。其自身的高保守性、共显性、位点特异性和基于 PCR 的扩增技术使 SSR 分子标记成为研究生物遗传多样性、遗传绘图和基因变化等经典而有效的分子标记17 19。SSR 序列基本上有两种类型:基因组-SSR(G-SSR)和表达序列标记-SSR(EST-SSR)。G-SSR 主要分布在整个基因组中，而EST-SSR 是基因组转录的部分，分布在 mRNA 中。EST-SSR 的高度保守性使其在预测遗传差异方面比 G-SSR 更加有效，且具有更高的近似种间通用性16 579，17。下一代测序技术(NGS)显著降低了获取大量序列数据的成本，推动了全基因组测序和转录组测序(RNA-seq)的快速发展，且已被广泛应用于无参考基因组信息的非模式生物相关研究中20 22。目前，有关造礁珊瑚的相关转录组测序数据及其分析已较为丰富21 23，但关于短指软珊瑚(Sinularia ceramensis)和花环肉质软珊瑚(Sarcophyton ehrenbergi)转录组测序及其相关研究却未见报道。本研究旨在基于转录组测序的结果进行短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚微卫星标记挖掘及其生物信息学特征的分析;开发短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚微卫星标记，筛选并开发 EST-SSR 分子标记;筛选并检验两种软珊瑚微卫星分子标记在同科跨属间的通用性，为软珊瑚在遗传结构研究和种类鉴定等方面提供71第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报借鉴。1 材料与方法1 1 材料短指软珊瑚和肉质软珊瑚样品采自三亚市西瑁洲岛(181572N，1092235E)珊瑚礁区。珊瑚物种鉴定基于形态学、MSH 和 COI 分子标记测序。利用软珊瑚科(Alcyoniidae)样本 4 属 11 种 30 株用于 EST-SSR 引物通用性研究分析(表 1)。表 1软珊瑚样本信息属种个体数SinulariaSinularia wanannensis5Sinularia slieringsi2Sinularia maxima1Sinularia flexibilis5Sinularia acuta3AldersladumAldersladum jengi4LobphytumLobophytum crassum1SarcophytonSarcophyton tumulosum1Sarcophyton trocheliophorum2Sarcophyton sp2Sarcophyton glaucum21 2 方法1 2 1 转录组文库的构建和 EST-SSR 检测方法参照 HASSAN 等人的方法用 Oligod T 磁珠富集法构建文库24。利用 Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪对构建好的文库做质量检测，合格后使用 Illumina Hi SeqTM2000 进行测序。使用 Trinity 软件25 过滤已污染或低质量的序列，进行组装，在此基础上进行 EST-SSR 的筛选检测及 EST-SSR 数据库构建。1 2 2 EST-SSR 通用性筛选采用 Primer Premier 5 程序在基因的保守区设计引物。以重复基元序列长度为2 6 个核苷酸重复，引物退火温度为 50 60、预计产物的长度以超过 85 bp 为标准，选择符合条件的 EST-SSR 引物，并在短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚间进行扩增筛选。PCR 扩增程序参考陆昊等26 的方法:95 预变性 5 min，95 变性 1 min，退火温度参考引物的退火温度，72 延伸 1 min，循环 15 次，最后 72 延伸 10 min。2 结果与分析2 1 EST-SSR 的数量和分布密度短指软珊瑚转录组序列的 N50 为 1 416 bp，164 825 个 unigene 中检测到 2 914 个微卫星;肉质软珊瑚转录组序列的 N50 为1 323 bp，154 826 个 unigene 中检测到2 335 个微卫星。短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚转录组序列分别平均每66 3 和56 7 个 unigene 中含有1 个微卫星，其微卫星的平均跨度分别为52 9 kb和 56 1 kb。短指软珊瑚微卫星密度大、跨度小，具有一定的物种间差异性(图 1)。短指软珊瑚微卫星中最多的重复类型为三核苷酸重复(67 2%)，其余依次为二核苷酸重复(19 9%)、六核苷酸重复(5 2%)、四核苷酸重复(4 2%)，分布最少的为五核苷酸重复(3 5%)。花环肉质软珊瑚微卫星中最多的重复类型81王沛政等:两种软珊瑚 EST-SSR 通用性引物的研发2023 年第 2 期为三核苷酸重复(77 0%)，其余依次为二核苷酸重复(18 6%)、六核苷酸重复(6 4%)、五核苷酸重复(3%)，分布最少的为四核苷酸重复(1 3%)。基元长度2肉质软珊瑚短指软珊瑚34560200400600800100012001400160018002000出现次数/次图 1短指软珊瑚和肉质软珊瑚不同长度的重复基元的数目特征2 2 EST-SSR 不同重复类型的数量与频率微卫星标记重复单元的数量与频率分析见表 2。短指软珊瑚共拥有139 种重复单元，花环肉质软珊瑚共拥有 122 种重复单元。短指软珊瑚重复单元类型最多的为 54 种三核苷酸重复，其余为 21 种六核苷酸重复单元、20 种四核苷酸重复单元、16 种五核苷酸重复单元和 12 种二核苷酸重复单元。花环肉质软珊瑚重复类型最多的为 54 种三核苷酸重复单元，28 种六核苷酸重复单元、25 种四核苷酸重复单元、20 种五核苷酸重复单元和 12 种二核苷酸重复单元。短指软珊瑚中二核苷酸微卫星共有 579 个，TA/AT 重复单元占比最高为 10 71%。短指软珊瑚三核苷酸微卫星共有 1 958 个，GCA/GAT 有 164 个，四核苷酸微卫星共有121 个，五核苷酸微卫星共有 102 个，六核苷酸微卫星共有 152 个。花环肉质软珊瑚中二核苷酸微卫星共有 405 个，TA/AT 重复单元最高占比为 8 33%。花环肉质软珊瑚三核苷酸微卫星共有 1 650 个，GAT/GAG 有 151 个(6 45%)，四核苷酸微卫星共有 31 个，五核苷酸微卫星共有 106 个，六核苷酸微卫星共有145 个(表 2)。表 2短指软珊瑚和肉质软珊瑚微卫星重复类型数量分布重复类型短指软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%肉质软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%二碱基重复TA/AT3120 107 11 337 7TA/AT1950 083 30 821 7TG/GA840 028 80 360 2TC/GT750 032 10 316 1TC/CT660 022 70 283 0AC/CT550 023 50 231 8AG/AC520 017 90 223 0800 034 20 337 1其他650 022 30 278 7三碱基重复GCA/GAT1640 056 30 703 2GAT/GAG1510 064 50 636 3TGA/ATC1510 051 90 647 4GCA/AAG1430 061 10 602 6GAG/CCA1350 046 40 578 8TCA/CAG1330 056 80 560 5AAG/GCT1230 042 20 527 4AGC/GCT1130 048 30 476 2ATG/TGG1200 041 20 514 5TGC/ACC960 041 00 404 691第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报表 2(续)重复类型短指软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%肉质软珊瑚重复单元重复数目比例/%发生频率/%三碱基重复CAG/CTT1180 040 50 505 9CAC/CCT910 038 90 383 5TAT/AGC1080 037 10 463 1GGA/CCA890 038 00 375 1GTG/TCA1030 035 40 441 6CTT/ATC840 035 90 354 0TGT/GGA1000 034 30 428 8CGC/CTC800 034 20 337 1GGT/CAA960 033 00 411 6TGA/CTG790 033 80 332 9TGC/ACC770 026 40 330 1其他5910 252 62 490 5CGC/CTC700 024 00 300 1其他5930 203 62 542 5四碱基重复1210 041 60 518 8310 013 20 130 6五碱基重复1020 035 00 437 31060 045 30 446 7六碱基重复1520 052 20 651 71480 063 20 623 7总计2 9122 340注:所占比例是指某种碱基重复单元的数量/核苷酸重复单元总数的比值 100%;发生度是指实际中出现的次数/某种核苷酸重复中一种基元发生期望值 100%。2 3 EST-SSR 重复基元长度分析短指软珊瑚和花环肉质软珊瑚转录组数据库中微卫星重复基元长度区间在 12