一株除臭细菌的筛选及鉴定_吴翔.pdf

一株除臭细菌的筛选及鉴定吴 翔，余 洋，谢丽源，（四川省食用菌研究所，四川成都；国家农业微生物新都观测实验站，四川成都）摘要 目的筛选获得分类地位明确、具有较好除臭效果的微生物菌株。方法通过平板涂布法从鸡粪发酵料中筛选具有除臭效果的菌株，并检测各菌株对鸡粪中氨气和硫化氢的降解率。通过表型特征、生理生化特征和遗传特征等多相分析来确定目的菌株的分类地位。结果筛选获得一株除臭细菌，对氨气和硫化氢的降解率分别达到了 和。鉴定结果表明，细菌 为原磷谷氨酸杆菌（），在 核酸登录号为。结论菌株 在无害化处理畜禽粪污方面具有一定的应用前景。关键词 除臭细菌；筛选；鉴定中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，），；基金项目 成都市重点研发支撑计划项目（）；四川省农业 科 学 院 国 际 科 技 交 流 合 作 提 升 行 动 计 划 项 目（）。作者简介 吴翔（），女，四川理县人，副研究员，博士，从事土壤微生物研究。收稿日期 随着经济发展，人民生活水平的提高，对肉、蛋、奶等产品的需求越来越大，促进了畜禽养殖业的快速发展。而畜禽养殖业的发展必然增加畜禽粪污产生的量，给环境带来新的压力。其中畜禽粪便中含有的大量蛋白质、氨基酸等营养物质被分解为、等恶臭气体，这些气体会引起周围强烈的刺激性，损害吸入群体的人身健康。目前对这些恶臭气体主要的处理方法有物理法、化学法和生物法，而生物法主要通过微生物降解、转化恶臭成分，具有成本低、不易产生二次污染等优点，因此是解决恶臭气体重要的研究方向。该研究从鸡粪发酵物中筛选降解 和 的微生物菌株，为后续研发除臭剂打下基础。材料与方法 培养基含氮富集液体培养基：蔗糖 ，蒸馏水 ，灭菌后的鸡粪浸出液 ，。培养基：胰蛋白胨 ，酵母提取物 ，琼脂粉 ，蒸馏水 ，。产气检测培养基：蔗糖 ，蛋白胨，酵母浸出粉 ，琼脂粉 ，蒸馏水 ，。样品采集及处理 在成都市大邑县、邛崃市采集鸡粪发酵物共计 个，称取样品各 分别置于富氮液体培养基中进行富集培养，放入、摇床振荡，后在转接到新鲜的培养液中培养，连续转接 次。菌株筛选 将富集后的培养液进行梯度稀释，选取适宜稀释度的稀释液 ，采用平板涂布法涂布于 培养基上，于 的恒温培养箱倒置培养，待菌长出后将纯化后的单个菌株接种到产气培养基，利用石蕊试纸和醋酸铅试纸检测各菌株的产气情况，菌株生长过程中产生 红色石蕊试纸将变为蓝色，产生 气体醋酸铅试纸将变为黑色。参照李玥等的方法，再次检测 种气体产气试验都不变色菌株的除氨和除 能力，确定筛选目标菌株。菌株鉴定 显微形态和培养形态特征分析。将筛选所得的目标菌株于 培养基上划线培养，于培养箱 培养 ，观察菌株形态特征，并对菌落形态拍照；挑取单菌落进行革兰氏染色，并于光学显微镜下观察其显微形态。生理生化特征分析。菌株大部分生理生化特征利用 型细菌鉴定仪的微孔板检测，具体按照 使用说明书步骤操作，其微孔板布局如图 所示。其他生理生化试验检测内容参照赵斌等的微生物学实验进行操作。将 培养基 含量调节为、和（），分别调节为、，检测菌株生长 范围和 耐受情况，检测菌株在、和 条件下的生长情况。菌株 基因序列的测定及系统发育树构建。参照细菌基因组 提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）的说明书提取细菌基因组。用细菌通用引物（正向引物 ，反向引物 安徽农业科学，（）：）参照张飞官等的方法扩增菌株 。产物在生工生物工程（上海）有限公司进行测序。将测得的 基因序列提交到，获得各菌株的登录号。参照张越己等的方法构建系统发育树。图 微孔板测试布局 结果与分析 菌株的分离 从 个鸡粪发酵物样品中分离获得 株菌株，其中细菌 株，放线菌 株。在利用试纸检测各菌株产生 和 气体的过程中发现，有 株细菌同时不产生 和，它们分别是、，分别检测了这 株菌的除氨和除 能力，结果如表 所示，从表 可看出，菌株 的除氨率和除硫化氢率均为 个菌株中最高的，分别达到了 和，因此选该菌为最优的目的菌株确定其分类地位。菌株的鉴定 形态特征。菌株 是革兰氏阳性的好氧细菌，在 培养基上的菌落呈现出隆起、边缘整齐的形状，菌株表面湿润，无可溶性色素，菌株为乳白色，培养过程中菌株颜色无变化，无金属光泽，在光学显微镜下观察发现该菌呈现杆状，如图 所示。表 菌株除臭结果 处理产生氨量 除氨率产生硫化氢量 除硫化氢率图 菌株 在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态（）和光学显微形态（）（）（）生理生化特征。菌株 培养 后在 鉴定板上的鉴定结果如图 所示。将该菌 鉴定板上的鉴定结果在数据库中比对，未发现有与该菌结果具有匹配可能性的菌株，距离最近的菌为 ，但与该菌的相似度（）为，距离（）为，无匹配可能性。鉴定结果表明该菌具有一定的耐酸性和耐盐性，可在 低至 和含 的培养液中生长，生长温度是 。可利用糊精、麦芽糖、纤维二塘、蔗糖、松二糖、水苏糖、棉子糖、蜜二塘、水杨酸、乙酰神经氨酸、葡萄糖、果糖、甘露醇、阿拉伯醇、甘油、丙氨酸、天冬氨 卷 期 吴 翔等 一株除臭细菌的筛选及鉴定酸、谷氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、果胶等生长。图 菌株 在鉴定板上的反应结果 菌株 基因部分序列分析。菌株 的 基因部分序列长度为 ，在 核酸登录号为。根据菌株 系统发育分析，菌株 属于贝氏谷氨酸杆菌属（）细菌，与该属菌株原磷谷氨酸杆菌 系统发育关系最近，其 基因相似性为；其次是菌株 ，相似性为；通过邻接法构建的基于菌株 相关菌株 基因部分序列的系统发育树如图 所示。结合其形态特征、生理生化特征和 基因部分序列分析结果，初步判定菌株 属于原磷谷氨酸杆菌（）。讨论在已有的降解畜禽粪污臭气方面的研究中，发现具有这类功能的微生物主要包括芽孢杆菌、镰刀菌、酵母图 通过邻接法构建的基于菌株 及相关菌株 序列的系统发育树 ，菌等，该研究所得的降解氨气和硫化氢的菌株为原磷谷氨酸杆菌（），已有的报道中该类菌主要具有产生 谷氨酸、谷氨酸等功能，鲜有该类菌用于降价畜禽粪污臭气成分的报道。该研究筛选出的菌株 对氨气和硫化氢都有较好的去除效果，具有研发为功能菌株生产除臭剂的潜力，为除臭菌剂的研发等后续研究打下了基础。参考文献 王志茹，彭旭阳，任丽梅高安屯卫生填埋场刚性调节池除臭新工艺的应用环境卫生工程，（）：许丽娟，王震，吴迎奔，等城市生活垃圾除臭微生物菌群的筛选江西农业学报，（）：张杰，李杭芬，赵由才，等垃圾填埋场苍蝇和恶臭污染控制技术研究进展环境污染与防治，（）：，吴见平，靳紫恒，长英夫，等污水处理厂生物除臭技术及其应用进展化工进展，（）：崔玉雪，郭广寨，黄皇，等用于填埋场恶臭气体控制的微生物除臭剂筛选及其除臭机制研究环境污染与防治，（）：，唐堇洢，王士雄，李何君，等畜禽场园林绿化与臭气减排控制研究现状安徽农业科学，（）：曾苏，李南华，盛洪产，等微生物除臭剂的筛选、复配及其除臭条件的优化环境科学，（）：李玥，李成成，李静，等鸡粪除臭菌的分离筛选及除臭效果分析农业环境科学学报，（）：陈玲，张攀浅谈臭气控制项目在下坪固体废弃物填埋场环境保护方面的作用广东化工，（）：赵斌，何绍江微生物学实验北京：科学出版社，张飞官，高雅慧，任慧爽，等桑疫病病原拮抗菌的分离、鉴定及发酵条件优化微生物学报，（）：张越己，秦盛，卞光凯，等具有 脱氨酶活性的麻疯树根际促生菌（）的分离筛选及系统发育分析微生物学通报，（）：，（）：宋繁永，史亚微，李天元，等高效养猪废水除臭菌株的筛选及条件优化环境科学与技术，（）：尹红梅，刘标，郭照辉，等 株畜禽粪便堆肥脱氨除臭菌的筛选及特性江苏农业科学，（）：叶芬霞，朱瑞芬，叶央芳复合微生物吸附除臭剂的制备及其除臭应用农业工程学报，（）：，（）：安徽农业科学 年