利用体外法研究绒山羊常用粗饲料的瘤胃发酵特性_赵艳丽.pdf

232023 年第 8 期中国饲料粗饲料为反刍动物提供大量的营养物质，是反刍动物重要的营养来源，我国反刍饲料仅占到国内动物饲料产量的 5.02%（农业农村部畜牧兽医局，2022），但随着畜牧业的不断发展，粗饲料的地位越来越重要。阿尔巴斯绒山羊是世界一流的绒肉兼用型品种，以放牧作为主要饲养方式，但过度放牧会使草场退化、土地沙漠化，导致我国草原可利用面积大幅下降。近年来，集约化养殖的阿尔巴斯绒山羊缩短了出栏时间，增加了产肉性能，并且这种饲养方式的转变大大改善了草原的生态环境，但也加剧了我国优质粗饲料资源的进一步短缺，由于进口粗饲料的成本过高，优质粗饲料的匮乏已经成为制约我国阿尔巴斯绒山羊集约化养殖发展的因素。为提高饲料利用价值，降低饲养成本，提高养殖场利润以及实践生产中合理配置日粮配方，研究阿尔巴斯绒山羊常用粗饲料的瘤胃发酵特性具有重要的理论与实际意义。反刍动物瘤胃的发酵功能直接反映瘤胃内营养物质的降解和消化吸收，进而间接反映其生产性能（郝小燕等，2017）。瘤胃发酵参数如 pH、氨氮（NH3-N）浓度、挥发性脂肪酸（VFA）、菌体蛋白（BCP）含量等均是反映机体营养状况，评定饲料营养价值的重要指标。体外法模拟瘤胃发酵具有省时省力，操作简单等优点，可以在一定程度上重现瘤胃内的消化过程（张清月，2019）。目前关于绒山羊对各种常用粗饲料的瘤胃发酵效果的研究较少，因此，本试验用多项组合效应指数（MFAEI）与体外批次培养法相结合，利用体外法研究绒山羊常用粗饲料的瘤胃发酵特性，以期为饲料原料资源在绒山羊生产中的合理利用提供一定的参考依据。1材料与方法1.1试验材料采自内蒙古呼和浩特内蒙古优然牧业有限责任公司的 6 种粗饲料（玉米秸秆、玉米青贮、燕麦草、羊草、谷草、苜蓿），经 65干燥制成风干样后粉碎过 40 目筛，密封保存以备用。1.2试验动物及日粮试验选择 3 只健康、体况相近的内蒙古阿尔巴斯白绒山羊羯羊（5 岁左右）作为瘤胃液供体动物。供体羊每天饲喂两次基础日粮，自由饮水。基础日粮的配制参照中国肉羊利用体外法研究绒山羊常用粗饲料的瘤胃发酵特性赵艳丽，张汀，杜霞，郭晓宇，郭咏梅，郑亚光，闫素梅*（内蒙古农业大学动物科学学院，动物营养与饲料科学自治区高等学校重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）摘要 文章旨在利用体外法研究绒山羊常用粗饲料的瘤胃发酵特性。采用单因素完全随机试验设计，通过体外三步法比较了 6 种粗饲料（玉米秸秆、谷草、苜蓿、玉米青贮、燕麦草、羊草）的体外瘤胃发酵参数，每种饲料作为一个处理，以玉米秸秆为对照组。结果表明，体外瘤胃pH以苜蓿最高，玉米青贮最低（P0.05）；BCP浓度苜蓿显著高于谷草、羊草和玉米秸秆，其中以玉米秸秆最低（P 0.05），体外瘤胃 NH3-N 浓度以玉米青贮最高，玉米秸秆最低，谷草也较低（P 0.05）。原虫数量以玉米青贮最高，苜蓿最低（P 0.05）。不同的粗饲料体外瘤胃培养液 TVFA 浓度以玉米青贮和苜蓿较高，玉米秸秆较低（P 0.05）；产气量以玉米青贮和苜蓿草较高，玉米秸秆和谷草较低。不同粗饲料多项组合效应值中，玉米青贮和苜蓿的 MFAEI 值较大，谷草次之，玉米秸秆最低（P 0.05）。说明绒山羊对玉米青贮和苜蓿具有较好的体外瘤胃发酵效果，玉米秸秆和谷草较差。关键词 绒山羊；粗饲料；体外发酵 中图分类号 S826 文献标识码 A 文章编号 1004-3314(2023)08-0023-06项目基金：农业部公益行业专项课题（201003061）*通讯作者DOI：10.15906/11-2975/s.20230806242023 年第 8 期中国饲料饲养标准（中华人民共和国农业部，2004），其日粮组成与营养水平见表 1。表 1 基础日粮组成及营养水平（DM 基础）日粮组成配比日粮营养水平配比苜蓿草/%27.20DE/（MJ/kg）12.31玉米秸秆/%52.80粗蛋白质/%11.50玉米/%4.80钙/%0.80大豆粕/%3.90磷/%0.40麸皮/%0.20中性洗涤纤维/%31.33玉米胚芽粕/%0.20酸性洗涤纤维/%19.45DDGS/%8.80预混料/%0.80磷酸氢钙/%1.00食盐/%0.30合计/%100注：（1）每 千 克 预 混 料 提 供 Fe 6 g，Cu 0.8 g，Zn 10 g，Mn 6 g，I 60 mg，Se 40 mg，维 生 素 A 600000 IU，维 生 素 D3 200000 IU，维生素 E 2500 IU。（2）表中除 DE 为计算外，其余均为实测值。1.3试验设计试验采用单因素完全随机试验设计，将粗饲料分为玉米秸秆、谷草、苜蓿、玉米青贮、燕麦草和羊草 6 个处理组，每个处理设 6 个重复，其中以玉米秸秆为对照组，所有处理组的培养体系为 60 mL（瘤胃液与培养液体积比为 1 2），培养底物分别为玉米秸秆、谷草、苜蓿、玉米青贮、燕麦草和羊草，各处理组培养时间为 48 h。1.4体外批次培养1.4.1培养液的配制参考Menke法（Menke等，1979）分别配制微量元素溶液、缓冲溶液、常量元素溶液、还原剂溶液和刃天青溶液。将上述制备好的试剂按表 2 所示比例混匀得到培养液，在水浴锅中温热到 38，持续通入二氧化碳（CO2）备用。表 2 Menke 缓冲液配制体系（1L）试剂名称含量/mL（1000 mL体系）微量元素0.12缓冲溶液237常量元素液237刃天青溶液1.22蒸馏水474还原剂49.5合计10001.4.2体外批次培养过程晨饲前从供体羊口中采集瘤胃液，经四层纱布滤入保温瓶（充满CO2，39预热），瘤胃液与培养液混合（体积比为 1 2）后，使 用 连 续 分 液 器（Eppendorf，德国）分装至培养瓶（120 mL）中，培养体系体积为60 mL。培养瓶中提前加入称量好的 1 g 底物，分装过程全程通 CO2。培养瓶于全自动产气记录装置（Agrs-III，美国）进行体外批次培养，再向发酵瓶通入 CO2后立即盖好瓶塞（张丽英，2003）。将装有不同饲料的培养瓶与产气装置对应的传感器相连接，39下连续培养。发酵结束后冰浴终止发酵。将体外瘤胃培养液用 4 层纱布过滤于离心管中备用。1.5测定指标与方法终止发酵后立即使用预先校正好的高精度便携式手持 pH 计（梅特勒，美国）测定 pH。1.5.1 原 虫 计 数 原 虫 计 数 参 考 王 洪 荣 等（2014）的方法利用染色镜检法对其进行测定。将样品吸取 1 mL 与 4 mL 甲基绿福尔马林溶液混合，对培养液中的原虫进行固定和染色，过夜后即可进行计数。1.5.2NH3-N 测定体外瘤胃培养液中 NH3-N浓度参照冯宗慈和高民（2010）改进的比色法进行测定。将样品用高速离心机（Eppendorf，德国）离心后取上清，用盐酸对 NH3-N 进行固定，于-20保存。将样品取出解冻后离心，吸取上清液于离心管内，并且依次加入 I 液（0.40 g 亚硝基铁氰化钠，溶于 500 mL 14%水杨酸钠中）、II液（10 mL 次氯酸钠溶液与 500mL 0.3 mol/L 的氢氧化钠溶液混合），混匀后点入 96 孔板内，静置10 min，用酶标仪（Synergy Hi，美国）测定吸光值（波长 700 nm），将测得的吸光值代入标准曲线公式，计算样品中的 NH3-N 浓度。1.5.3BCP 浓度测定将样品于 4000 r/min 离心 15 min，取上清液样品于-20保存，用于 BCP测定。取 1.2 mL 上清液，12000 r/min 低温离心20 min 弃上清液；加入 1 mL 0.9%生理盐水冲洗沉淀，重复上述清洗步骤一次；加入 1 mL 细菌蛋白抽提试剂重悬，室温孵育 15 min，15000 r/min252023 年第 8 期中国饲料离心 5 min，取 25 uL 上清，加入 1.5 mL 考马斯亮蓝显色液混匀，静置 10 min 后，取 200 uL 混匀溶液点入 96 孔板，静置 2 min 后，利用酶标仪在 595 nm 比色，根据计算公式计算出 BCP 浓度，具体公式如下：待测样本蛋白浓度/（g/L）=C标准N；其中，C标准代表标准液浓度，0.524 g/L；N 表示样本测试前稀释倍数。1.5.4VFA 浓度测定将样品于 4000 r/min 离心 15 min，取 4 mL 上清于含 1 mL 浓度为 25%的偏磷酸离心管中，于-20保存，用于固定 VFA浓度。VFA 浓度用气相色谱仪（岛津，日本）测定，测定方法参考李敏（2015）的气相色谱法。1.5.5产气量测定利用全自动产气记录装置（Agrs-III，美国）记录 3、6、9、12、24、48 h 的实时产气量。1.6单项组合效应指数（SFAEI）与 MFAEI 的计算具体计算公式如下：（1）SFAEI 计算公式：SFAEI=；式中：m 为各发酵时间点；n 为发酵时间点的总次数；A1m为组合前（对照组）各单一指标 n个发酵时间点的值；A2m为组合后（试验组）各单一指标 n 个发酵时间点的值；单项指标为营养物质体外降解率、NH3-N、BCP、产气量和总挥发性脂肪酸（TVFA）。（2）MFAEI 为各单项组合效应值之和。1.7数据处理试验数据采用 SAS 8.1 进行单因素方差分析（ANOVA），采用 Duncan s 法进行多重比较。P 0.05 表示组间差异显著：P 0.05表示组间差异不显著，0.05 P 0.10 表示组间差异趋于显著（王霞等，2021）。2结果2.1不同粗饲料对体外瘤胃发酵参数的影响由表 3 可知，不同粗饲料体外发酵后，pH 以苜蓿最高，显著高于其他粗饲料（P 0.05），玉米青贮最低（P 0.05）。原虫数量以玉米青贮最多，显著高于其他处理组（P 0.05），苜蓿最小，显著低于其他各组（P 0.05）。NH3-N 浓度以玉米青贮组显著高于苜蓿组，二者均显著高于其他处理组（P 0.05），玉米秸秆最低，显著低于其他处理组（P 0.05）。BCP 浓度苜蓿显著高于谷草、羊草和玉米秸秆，其中以玉米秸秆最低，显著低于其他处理组（P 0.05）。表 3 不同粗饲料对体外瘤胃 pH、NH3-N 浓度、BCP 浓度和原虫数量的影响组别pH原虫数量/（104个/mL）NH3-N浓度/（mg/100 mL）BCP浓度/（mg/100 mL）玉米秸秆5.76e4.45b1.57e73.67d谷草6.09c4.19b2.16d84.09b苜蓿6.22a1.58c4.55b87.41a玉米青贮5.49f6.38a4.64a86.30ba燕麦草6.17b4.21b2.96c84.31ba羊草6.05d3.75b2.58c80.03cSEM0.0110.2880.0250.825P值0.00010.00010.00010.0001注：同列数据肩标相同字母或无肩标表示差异不显著（P 0.05），肩标相邻字母表示差异显著（P 0.05）。2.2不同粗饲料对体外瘤胃发酵 VFA 浓度的影响由表 4 可知，各处理组体外发酵后，苜蓿和谷草的乙酸浓度显著高于其他处理组（P 0.05）。玉米青贮的丙酸和丁酸浓度最高，显著高于其他处理组（P 0.05），异丁酸、戊酸和异戊酸浓度均以苜蓿最高，显著高于其他处理组（P 0.05），玉米秸秆最低，显著低于其他处理组（P 0.05），谷草也较低。对于 TVFA 浓度，玉米青贮、苜蓿较高，二者显著高于其他处理组（P 0.05），玉米秸秆最低，显著低于其他处理组（P 0.05）。乙丙比谷草、燕麦草和羊草较高，显著高于其他组（P 0.05），玉米青贮组最低。2.3不同粗饲料对体外瘤胃发酵产气量的影响 由表 5 可知，体外培养 3、9、12、24 和 48 h 玉米青贮的产气量均显著高于其他处理组（P 0.05），3、9、12 和 24 h 以玉米秸秆的产气量最低，48 h以 玉 米 秸 秆 和 谷 草 较 低（P 0.05）。体 外 培养 6 h 时，玉米青贮和苜蓿显著高于其他组