利用CRISPR_Cas9...αV及ITGβ3敲除细胞系_胡艺欣.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月利用 CRISPR/Cas9系统构建 ITGV 及 ITG3敲除细胞系胡艺欣1#，吴兴一1#，李泽辉1，靳晓慧1，胡慧1，2*（1.河南农业大学 动物医学院，郑州 450002；2.河南省动物食品安全重点实验室，郑州 450002）摘要：本试验旨在采用 CRISPR/Cas9技术获得整合素 V（Integrin V，ITGV）及整合素 3（Integrin 3，ITG3）基因敲除的猪睾丸（Swine testicle，ST）细胞系，进而在细胞水平上研究 ITGV 及 ITG3 在猪 冠状病毒（Porcine deltacorovirus，PDCoV）入侵过程中的作用及相互作用机制。根据 GenBank上猪的 ITGV 及 ITG3基因序列分别设计三对引导 RNA（sgRNA），并整合到 LentiCRISPRV2 载体上，与辅助质粒 pSPA2 及 pMD2.G 共转染 293 T细胞进行慢病毒包装，包装完成后感染 ST 细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用 T7酶进行酶切检测，选出编辑效率较高的细胞群体，进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的 STITGVKO（敲除 ITGV 基因的 ST细胞）及 STITG3KO（敲除 ITG3基因的 ST细胞）的单克隆细胞系进行测序和 Western Blotting鉴定，结果显示 ITGV 与 ITG3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行 PDCoV 感染试验，结果表明敲除 ITGV、ITG3基因均可抑制 PDCoV 在 ST 细胞内的增殖，成功构建的 STITGVKO及 STITG3KO细胞系为后续阐明 ITGV、ITG3在PDCoV入侵过程中的作用提供了细胞模型。关键词：整合素 V；整合素 3；CRISPR/Cas9；猪睾丸细胞；猪 冠状病毒中图分类号：S828.9 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02049108DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004292冠状病毒是目前已知最大的单股正链 RNA 病毒，具有广泛的宿主谱，可感染哺乳动物和鸟类，导致胃肠道、呼吸道和神经系统疾病。根据基因型的不同，冠状病毒可分为 冠状病毒属、冠状病毒属、冠状病毒属和 冠状病毒属1。目前可导致猪肠道疾病的冠状病毒有 冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染 性 胃 肠 炎 病 毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪肠道甲型冠状病毒（Swine enteric alpha corona virus，SeACoV）、猪急性腹泻综合征冠状 病 毒（Swine acute diarrhea syndrome corona virus，SADSCoV）以及 冠状病毒属的猪 冠状病毒（Porcine deltacorovirus，PDCoV）。PDCoV 作为 冠状病毒属的新成员，具有较高致病性，临床上可引起猪呕吐、腹泻、脱水等症状，哺乳期仔猪感染后致死率可达 30%40%，给养猪业带来严重的经济损失。PDCoV 具有跨种传播特性，可以感染猪2，3、鸡4、牛5等多种动物，同时也可以感染人的细胞。2021 年 John A.Lednicky 等人在三名患有急性未分化发热性疾病的海地儿童的血浆样本中鉴定出 PDCoV6，提示 PDCoV 具有跨种感染人的风险。病毒感染宿主细胞的第一步是与宿主细胞表面的受体结合，在对 PDCoV 入侵受体的研究过程中发 现 PDCoV 在 敲 除 猪 氨 基 肽 酶 N（Porcine aminopeptidase N，pAPN）的细胞中感染率显著降低，且瞬时表达 pAPN 的细胞对病毒敏感7；Yang 等人发现 PDCoV 和 pAPN可与内吞标记物共定位，提示 pAPN 通过内吞途径介导 PDCoV 进入细胞8。也有研究表明，敲除 pAPN 或用 APN 特异性抗体和抑制剂治疗并不能完全阻断 PDCoV 的入侵，表明pAPN 在 PDCoV 入侵宿主细胞过程中起着重要作用，但却不是 PDCoV 入侵细胞的功能性受体9。袁一心等人发现用神经氨酸酶破坏细胞表面的唾液酸后能显著降低 PDCoV 的感染10，揭示了在 PDCoV收稿日期：20220802；接受日期：20221101基金项目：国家自然科学基金面上项目（项目号：31972678），题目：整合素 V3 在猪 冠状病毒入侵宿主细胞过程中的作用研究；国家自然科学基金（项目号：31772773），题目：猪 冠状病毒受体筛选、鉴定以及 S蛋白介导的细胞入侵机制研究；河南省高校科技创新人才支持项目（项目号：20HASTIT040），题目：整合素在猪 冠状病毒复制过程中的功能研究#共同第一作者：胡艺欣和吴兴一作者简介：胡艺欣（2000），研究方向动物分子病毒学与免疫学，Email：；吴兴一（1998），研究方向动物分子病毒学与免疫学，Email：通讯作者：胡慧（1976），教授，研究方向动物分子病毒学与免疫学，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷感染宿主细胞的过程中存在着共受体和辅助受体的参与。整合素（Integrin，ITG）是 亚基和 亚基通过非共价键结合形成的细胞表面黏附分子11，可与多种配体结合进而调节多种细胞功能12，13，如细胞黏附、细胞迁移、细胞分化以及细胞凋亡等过程。病毒可利用整合素的这些功能完成对易感细胞的吸附和穿入，但在不同病毒的吸附和穿入过程中，整合素担任 着 不 同 的 角 色。2013 年 Schmidt K 等 人 发 现ITG3不与西尼罗河病毒（WNV）靶细胞结合，但可增强 WNV 的感染效率14。Cheshenko N 的研究显示单纯疱疹病毒 2 型糖蛋白 H 可与 ITGV3 相互作用，促进病毒进入人体生殖道上皮细胞并促进钙信号转导15。Fan W 等人发现 ITGV3 可通过结合日本脑炎病毒（JEV）包膜蛋白的 ArgGlyAsp（RGD）基序进而调节 JEV 的进入16。Davor Nestic发现 ITGV3 可作为人类腺病毒 26 型（HAdV26）的 受 体 介 导 病 毒 感 染 上 皮 细 胞17。人 新 冠 病 毒（SARSCoV2）的已知受体血管紧张素转化酶 2（Angiotensinconverting enzyme，ACE2）上有保守的 RGD 基序，整合素可通过与 ACE2结合来掩盖受体，为 SARSCoV2 的防治提供了新的思路18，19。目前也有研究发现整合素在猪冠状病毒的感染过程中起到一定作用，2019 年 Chunqiu Li等人的研究表明 ITGV3与 pAPN 对 Vero E6细胞和 BHK21的PEDV 感 染 具 有 协 同 作 用20。Lv Xiaoling 发 现ATN161通过抑制 ITG51FAK 信号通路减少猪血 凝 性 脑 脊 髓 炎 病 毒（PHEV）在 小 鼠 体 内 的增殖21。基于以上研究，本文旨在采用 CRISPR/Cas9技术对 PDCoV 易感细胞猪睾丸细胞进行敲除，构建ITGV 及 ITG3敲除细胞系，进而在细胞水平上研究 ITGV 及 ITG3 在 PDCoV 入侵过程中的作用及相互作用机制。材料与方法1 病毒、细胞及质粒PDCoV HNZK 02（GenBank 登 录 号 为MH708123）株由本实验室分离并保存；ST 细胞、293 T 细 胞、质 粒 LentiCRISPR V2、pSPA2 和pMD2.G由本实验室保存。2 主要试剂大肠杆菌 Top10 感受态、Trizol 试剂、嘌呤霉素、10 000Gel Red 购自索莱宝公司；限制性内切酶 Bsmb I、T4 DNA 连 接 酶、蛋 白 预 染 Marker、Lipofectamine 2 000 转染试剂购自 NEB 公司；胶回收试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒、微量 DNA 提取试剂盒购自 OMEGA 公司；DMEM 培养液购自博士德生物公司；OPTIMEM、MEM、新生牛血清FBS、trypsin 购自 Gibco；ITGV 抗体购自 Abcam；HRP 标记羊抗鼠 IgG、HRP 标记羊抗兔 IgG 购自武汉三鹰生物科技有限公司；ITG3 兔源多克隆抗体由本实验室制备并保存。3 sgRNA靶点的设计从 GenBank 网站上查询猪源 ITGV 及 ITG3基因序列，针对二者转录本的第一个外显子分别设计 3 对引导 RNA（sgRNA），同时在 sgRNA 序列的5 端加上 CACCG/AAAC 粘性末端以便后续与载体 结 合，将 上 述 sgRNA 命 名 为 sgITGV 1、sgITGV2、sgITGV3、sgITG31、sgITG32、sgITG33，引物序列如表 1 所示，由奥科鼎盛生物科技有限公司合成。4 重组质粒构建4.1 引物退火杂交取 sgRNA 的上下游引物各 5 L（浓度为 100 M）在 PCR 仪中退火杂交，反应程序如下：95 5 min，从 95 按 2/s快速降温至 85，再从 85 按0.1/s缓慢降温至 25，4 30 min。反应结束后用 ddH2O 将 PCR 产 物 进 行 100 倍 稀 释 并 放 于20 保存。4.2 酶切 LentiCRISPRV2载体载 体 在 37 酶 切，反 应 体 系 如 下：LentiCRISPRV2 为 2 L，10NE Buffer2 为 3 L，表 1sgRNA引物序列Table 1Primer sequences for sgRNANamesgITGV1sgITGV2sgITGV3sgITG31sgITG32sgITG33Primer Sequence（53）F：CACCGGCCTCTTGCTCCTTCTCCCCGGR：AAACGGGAGAAGGAGCAAGAGGCCF：CACCGCTAGACGTGGACAGTCCTGCGGR：AAACCAGGACTGTCCACGTCTAGGF：CACCGCCCCGAAGGAAGTTACTTCGGGR：AAACGAAGTAACTTCCTTCGGGGCF：CACCGTGGGGGCGCTGGCGGGCGTCGGR：AAACACGCCCGCCAGCGCCCCCACF：CACCGCTCTGGGCCGCTGTGCTGGTGGR：AAACCCAGCACAGCGGCCCAGAGCF：CACCGCGCTGGCGGGCGTCGGCGTCGGR：AAACACGCCGACGCCCGCCAGCGC 4922期胡艺欣，等.利用 CRISPR/Cas9系统构建 ITGV及 ITG3敲除细胞系Bsmb I 为 1 L，ddH2O 为 24 L。3 h 后进行琼脂糖凝胶电泳并对酶切产物进行胶回收，胶回收步骤按照 OMEGA胶回收试剂盒的说明书进行。4.3 sgRNA与酶切载体连接用 T4 连接酶将 sgRNA 与 LentiCRISPRV2 载体在 16 低温连接槽中过夜连接。反应体系如下：LentiCRISPRV2 为 6 L，sgRNA 为 2 L，T4 DNA Ligase为 1 L，10T4 Buffer为 1 L。4.4 连接产物转化 TOP10感受态细胞将 5 L 的连接产物加入 50 L 的 TOP10 感受态细胞，轻轻吹 打 混 匀 后 冰 浴 30 min，42 热 激90 s，冰浴 5 min，加入 600 L无抗性的 LB 培养液在37 恒温摇床上 悬 浮 培 养 1 h，5 000 g 离 心10 min 后，弃去 400 L 液体，剩余菌液吹散后均匀涂布于氨苄青霉素抗性的 LB 平板上，在 37 恒温培养箱中先正放培养 30 min再倒放培养 16 h。挑取光滑圆润的单菌落送尚亚公司测序，用 D