抗菌肽和植物精油体外抑菌效果研究_王凯.pdf

病害监测060当代水产 2023320233当代水产061抗菌肽和植物精油体外抑菌效果研究 王凯1 沈娟娟1 阮鹏飞2（1 江门市澳保生物科技有限公司；2 江门市动物疫病预防控制中心）我国是水产养殖大国，随着集约化养殖，水产动物疾病呈多发、复杂状态，生存环境恶化。由于预防并治疗鱼病等原因，人为在饲料中添加大量抗生素，这种方式带来了一系列问题，比如药物残留、耐药性及其毒副作用等，这些问题严重危害着水产品安全与人类健康。针对这一现状，在水产养殖过程中使用替抗产品迫在眉睫。抗 菌 肽（A n t i m i c r o b i a l peptide；AMP）是一类两亲性阳离子型短肽，长度约为10100个氨基酸残基。作为先天性免疫防御系统的重要组成部分，抗菌肽是自然界在长期进化过程中形成的一类天然抗病活性多肽因子，在所有生物防御外源病原微生物的第一道防线中起着不可或缺的重要作用。植物精油属于天然、绿色、无残留物质，具有来源广泛、抗菌谱广、作用迅速、不易产生耐药性等特点。牛至油已被我国农业部批准作为一种可长期添加的药物饲料添加剂，从而说明天然植物提取物有望替代抗生物，具有较大的市场潜力。本研究针对从市场上收集的抗菌肽样品和植物精油样品进行体外抑菌实验，比较所有样品对水产常见致病菌大肠杆菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌等的抑菌效果对比，从而筛选出有显著抑菌作用效果的抗菌肽和植物精油产品，为实际养殖提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料注：-表示无明显抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明抑菌作用越强。表2 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的最小抑菌浓度表1 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的抑菌效果1.1.1 指示菌株大 肠 杆 菌（E s c h e r i c h i a c o l i）、副 溶 血 弧 菌（V i b r i o Parahemolyticus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia s e r i o l a e）、无 乳 链 球 菌（Streptococcus agalactiae）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii），以上菌种均由江门市澳保生物科技有限公司菌种保藏中心提供。1.1.2 抗菌肽和植物精油1 0 个 不 同 厂 家 生 产 的 抗 菌 肽（Antimicrobial peptide,AP）和植物精油产品均为市售产品，由江门市澳保生物科技有限公司收集。10个抗菌肽产品分别标记为AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-5、AP-6、AP-7、AP-8、AP-9、AP-10，植物图3 网箱拌喂产品A后肝脏修复切片表1 网箱拌喂产品A后肝脏修复效果图4 拌喂产品A后增重、增重率、吃料量、饵料系数比较对照组，投喂普通饲料，另一组为实验组，投喂拌有中草药护肝产品A的药饵，每天拌喂2次，连续拌喂7d，于第0d、第7d进行取样，每次随机取样10条鱼，观察肝脏情况。记录每日吃料量，采样前鱼体总重，采样后每条鱼体重、肝脏重，计算增重、增重率、吃料量、饵料系数。增重=鱼体末重-鱼体初重增重率=（鱼体末重-鱼体初重）/鱼体初重100%吃料量=每日吃料量吃料天数饵料系数=每日吃料量吃料天数/增重100%2 结果2.1.肝脏分级根据养殖经验，对鱼体不同状态下的肝脏进行分级，为后续实验的分析提供判断依据。1级肝脏：肝脏为猪肝红，肝脏状态最好，不需调理；2级肝脏：肝脏颜色较猪肝红淡，呈现为粉红色，肝脏状态尚可，可调理也可不调理；3级肝脏：肝脏红润或粉红带白斑或黄斑，肝脏状态较差，需要调理；4级肝脏：肝脏完全转变为白色或黄色，肝脏状态很差，急需调理。2.2 产品A护肝效果初步检验2.2.1 肝脏外观观察实验第0d，加州鲈鱼肝脏发黄，均为4级肝脏；拌喂产品A 7d后，加州鲈鱼肝脏好转，4条肝脏为略微粉红，2级肝脏，1条肝脏为发黄，4级肝脏；拌喂产品A 14d后，加州鲈鱼肝脏基本修复完全，3条红润，1级肝脏，2条粉红，2级肝脏（图2），表明随着时间的增加，在产品A的作用下，加州鲈肝脏逐步修复。肝脏切片结果表明，加州鲈胰腺埋于肝脏中，围绕血管分布。在使用产品A前，肝脏发黄，血管周围的胰腺组织完全消失；使用产品A 7d后，肝脏粉红，血管周围的胰腺部分修复，部分出现病变，胰腺部分肿大、出现大量嗜酸性小体和空泡；使用产品A 14d后，肝脏红润，胰腺组织恢复正常，围绕血管均匀分布。实验第0d，对照组和产品A组12级肝脏的占有率分别为40%和20%，34级肝脏的占有率分别为60%和80%，实验第7d，对照组12级肝脏和34级肝脏占有率相比于第0d没有变化，而产品A组12级肝脏占有率显著上升，为80%，34级肝脏的占有率显著下降，为20%（表1），说明产品A对肝损伤的加州鲈肝脏修复效果明显。实验结果表明，投喂产品A组增重、增重率、吃料量、饵料系数均明显优于对照组，说明鱼体肝脏的修复有利于鱼体的生长。3 讨论肝脏是鱼体维持内环境稳态最核心的器官之一，当机体出现代谢紊乱和病变时，肝脏状态也随之发生变化，如肝脏由光滑有弹性转变为豆腐状、易脆等，颜色由猪肝红转变为黄肝、花肝、白肝、绿肝等（黄春红等，2019；汪开毓等，2001）。在加州鲈养殖过程中，肝脏的颜色是否红润通常是评价鱼体是否健康的依据之一。在本研究中，我们选择肝脏条件很差的鱼类进行了两组不同维度的肝脏修复实验，一组是纵向比较实验，另一组是横向比较实验，两组实验均发现损伤的肝脏在使用产品A后明显变得红润，说明产品A对加州鲈的肝脏有明显的修复效果。同时，我们注意到两组肝脏修复实验的修复时间明显不同，一组14d完全修复，另一组7d完全修复，说明用药后，肝脏修复的时间并非是固定不变的。这可能与肝脏的损伤程度、天气的变化以及水质等有关，在多次的养殖实验中，我们发现当肝脏损伤程度越轻，修复的时间越短，反之越长。同时，好的天气条件好和水质条件也会加速肝脏的修复。同肝脏一样，胰腺也是鱼体重要的消化腺和内分泌腺，在鱼类的消化和吸收、血糖调节方面发挥着重要的作用，其分布在硬骨（下转63页）（注：a、肝脏发黄；b、肝脏粉红；c、肝脏红润。H：肝细胞；V：空泡；AB：嗜酸性小体；BV：血管；P：胰腺。）20233当代水产063062当代水产 2023320233当代水产063肉桂醛降低菌体膜电位，影响其代谢活性，从而抑制细菌生长，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有极强的抑菌作用。许君茹等发现抗菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有一定程度的抑制作用，其对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小MIC分别为20ug/mL、20ug/mL和40ug/mL。而在本研究中抗菌肽AP-1和AP-4、植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚对大肠杆菌的最小MIC为125ug/mL。罗振福等也报道了天蚕素对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。然而不同文献报道的植物精油和抗菌肽对细菌的最小MIC值存在一定的差异，这可能与不同厂家的抗菌肽和植物精油的纯度有关。这与本试验抑菌结果及最小MIC结果一致，不同厂家抗菌肽和植物精油对不同致病菌的抑菌作用有所差异，其对致病菌的抑菌作用越强，其最小MIC越小，反之亦然。为验证植物精油单独使用时和其它抑菌分子联合起来使用的效果对比，众多学者开展相关研究。张皓然等报道，植物精油与柠檬酸复合使用时具有协同作用，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制效果。王康莉将植物精油进行复配，使用牛津杯法研究其抑菌效果，研究报道将肉桂醛与香兰素按照 41进行复配时，对金黄色葡萄菌与沙门氏菌表现出最强的抑制效果。在本研究中，抗菌肽AP-1和AP-4和4种植物精油分别按照11进行复配，对各致病菌的抑菌作用较单一产品的抑菌作用效果显著提升。为产品抑菌效果提升提供新思路。4 结论本文研究了10个厂家生产的抗菌肽产品和4种植物精油对大肠杆菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌的抑菌作用，发现不同抗菌肽和植物精油的抑菌功能有极大差异，其中抗菌肽AP-1和AP-4抑菌作用最佳，植物精油除桉叶素以外，其它3个植物精油均有较强的抑菌作用。通过对抗菌肽AP-1和AP-4及植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚对致病菌的最小抑菌浓度检测，发现植物精油对各菌的最小抑菌浓度基本在125ug/mL就有抑菌作用，抗菌肽AP-1和AP-4对不同菌的最小抑菌浓度有较大差异，基本在125ug/mL500ug/mL之间。对抗菌肽AP-1、AP-4和4种植物精油之间的相互作用也进行了研究，AP-1、AP-4和4种植物精油复配后对各致病菌的抑菌作用较单一产品的抑菌作用效果显著提升，表明它们之间存在协同增效的作用，为实际产品应用提供可行性参考。注：-表示无明显抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明抑菌作用越强。表3 不同抗菌肽产品和植物精油联合使用对致病菌的抑菌效果精油产品分别为桉叶素、香芹酚、肉桂醛、百里香酚。1.1.3 培养基TCBS培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）、脑心浸出液肉汤（BHI）、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。1.1.4 仪器设备超净工作台（SW-CJ-1D）：购自苏州博莱尔净化设备有限公司；紫外分光光度计：购自北京普析通用仪器有限责任公司；恒温震荡摇床（THZ-98AB）和生化培养箱（LRH-70）：购自上海一恒科学仪器有限公司；超声仪（KQ-400E）：昆山市超声仪器有限公司；购自灭菌锅（BKQ-B50）：购自山东科博仪器有限公司。1.2 试验方法1.2.1 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的抑菌试验1.2.1.1 抑菌圈测定菌液制备：分别将大肠杆菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌接种在营养平板上，副溶血弧菌接种在TCBS平板上，37培养24h；鰤鱼诺卡氏菌接种在TSA上，28培养。将培养后的单菌落接种至50mL的无菌营养肉汤液体培养基中，鰤鱼诺卡氏菌接种在BHI液体培养基中，分别震荡培养24h。测试菌的配制：将上述测试菌培养液放置于常温后，置分光光度计于600nm处测吸光值至1.0，并将上述菌液稀释10倍备用。培养皿制备：将灭菌后的营养肉汤培养基放置到60左右开始倒培养皿，每个培养皿倒1520mL左右，倒好后水平静置使其在水平台面上凝固，备用。样品制备：10%溶液制备：精密称定待测的试样5.00g，加入灭菌水45.00g，配制成10%溶液，40超声水浴15min使其溶解。吸取适量上述溶液于离心管中，10,000rpm离心5min，取上清液过0.45m滤膜，滤液作供试样品溶液。试验菌的接种：用移液枪吸取步骤1.2菌悬液0.1mL，将其移至到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀，盖好培养皿。添加抑菌剂：用消毒的打孔器在培养皿上打孔，各孔中心之间相距 25mm以上，用移液枪吸取100L溶液至琼脂孔内，盖好培养皿，正置培养。结果的判定：经37培养箱中培养24h后，无透明的抑菌圈，则没有抑菌作用；有透明的抑菌圈，则有抑菌作用，抑菌圈越大表示样品对检测菌的抑制作用越强。1.2.2 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的最小MIC测定选取上述试验中抑菌效果最好的植物精油作为后续试验所用的植物精油。采用二倍稀释法结合抑菌圈测定最小抑菌浓度，稀释后的浓度分别为1000、500、250、125、62.5ug/mL，然后按照1.2.1方法进行抑菌试验。培养结束后，查看加对应浓度的孔是否出现透明的抑菌圈，则最低浓度出现抑菌圈的浓度极为最小抑菌浓度。1.2.3 不同抗菌肽产品和植物精油联合使用对致病菌的抑菌试验根据抑菌试验结果，筛选出抑菌效果好的抗菌肽和植物精油产品，然后将抗菌肽产品和植物精油分别按11进行复配，按1.2.1方法进行抑菌试验。2 结果与分析2.1 不同抗菌肽产品和植物精油产品对致病菌的抑菌试验结果对所有收集的抗菌