冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测方法研究_江凤玲.pdf

冷冻水产品主要是指采用低温工艺加工制作的产品，一般采用全冷链运输。欧洲、美国等发达国家已经在生产、加工、仓储、配送、售后服务等方面形成了一套完整的冷链食品物流体系。与发达国家相比，中国冷链食品产业正处于快速发展中，但仍然还有很大的差距，存在着诸多问题，食源性病毒以及食源性病原菌污染现象较为严重，食源性病原体导致的公共卫生事件在国内有较多报道 1 9。在适合的环境条件下，冷链食品中的病原菌可能呈对数级增长，严重威胁人民身体健康，带来较大的食品致病菌感染风险。本文研究对象冷冻水产品在冷链物流包装与运输中若未能精确控制温度，不仅容易受到微生物污染，而且还会因为合适的温度以及充足的营养基质导致微生物大量繁殖，带来食品腐败变质、人民群众感染等食品安全问题 1 0 1 5，对食品生产加工以及储存运输企业以及国家省市相关监管部门带来巨大的挑战。为开展相关检验工作以及监管工作提供技术方法与手段，本研究应用基于基因组学的实时荧光定量P C R 检测技术进行方法开发与测试，建立系统稳定的冷冻水产品中副溶血性弧菌的P C R 检测方法。副溶血性弧菌（V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s）能耐受高盐，主要分布于海产品还有腌制食物中 1 6 2 3，在海水产品中检出率较高 2 4 2 7，若不小心摄入含有副溶血性弧菌的食品易导致腹泻、呕吐等中毒现象，这就为冷冻水产品这一类产品带来了一定的食品安全风险。目前，我国已经制定了相关检验标准，如国家标准G B 4 7 8 9.7 2 0 1 3 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 2 8 等。但是，该标准检验方法主要检验流程包括预增菌、*基金项目：福建省科技计划项目冷链食品中病毒与病原菌的基因组学检测方法研究与溯源分析（项目编号：2 0 2 1 Y 0 0 5 8）。收稿日期：2 0 2 2-1 2-1 3作者简介：江凤玲（1 9 7 6），福建龙岩人，高级工程师，主要从事食品及相关产品的质量分析研究。江凤玲 福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量监督检验中心（福州），福建 福州 3 5 0 0 0 2 摘 要：文章研发了一种可在1 6 h 内完成冷冻水产品中副溶血性弧菌快速检测的方法。方法在首先完成样品的预增菌工作后，采用高温热裂解法与核酸亲和膜吸附法提取冷冻水产品等样品中的检材总D N A，设计副溶血性弧菌专一引物探针，运用实时荧光定量P C R 技术扩增试样中副溶血性弧菌基因组保守基因片段，同时开展与国家标准方法的比对工作证实方法的可靠性，建立了特异性好、高检测通量的P C R 检测方法。为验证所建立方法的适用性与稳定性，本研究从市场中随机抽取共3 3 1 份冷冻水产品样品开展副溶血性弧菌的筛查检测，结果表明采用该方法在上述抽样调查的冷冻水产品中3 份样品的副溶血性弧菌特异性的基因片段被扩增检验出，试样的目标菌检出率约为0.9%(3/3 3 1)，该研究P C R 方法的D N A 检出限可达到0.0 1 n g/L。关键词：冷冻水产品；副溶血性弧菌；实时荧光P C RD o i：1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 7-5 5 0 X.2 0 2 3.0 3.0 0 1中图分类号：O 6 5 7.3；T S 2 0 7.4 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 7-5 5 0 X（2 0 2 3）0 3-0 0 0 6-0 5冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光P C R 检测方法研究*论文江凤玲：冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光P C R 检测方法研究选择性培养基选择性增菌、目标菌株分离培养、血清学生化鉴定等步骤，耗时较长，需要一周时间才能确定实验结果，无法满足食品安全快速检测需求。另外，由于水产品基质复杂，包含了蛋白质、核酸、糖类以及脂质等成分，对于目标微生物核酸的检测干扰很大，给目标菌检测带来了很大难题。为了提高检测时效性、降低实验成本，本文基于国家生物信息技术中心（N C B I）检索的副溶血性弧菌全基因组序列设计专一性引物探针，利用分子生物学手段针对副溶血性弧菌开发了基于核酸的特异性检测方法，可以从复杂的各种食品基质中扩增出副溶血性弧菌基因片段。方法技术路线主要包括前期调研、目标菌扩增所需引物探针的设计与委托合成、实验标准菌株样品溶液以及标准菌株D N A 制备、样品的采集与低温储运、样品预增菌、样品中核酸提取、D N A 质量检查、实时荧光P C R 检测与数据统计分析等步骤。1 材料与方法1.1 材料和试剂1.1.1 标准菌株实验用标准以及对照菌株均购自全球生物资源保藏中心，有相应的菌株证书以及菌株编号。所有菌株均采用先进的磁珠冻存法妥善保存于二级生物安全实验室，由专人负责保管，双人双锁，定期复苏进行菌株核查，保证菌株的有效性。1.1.2 冷冻水产品样品采集冷冻水产品等样品采用无菌抽样方式采集自福建省主要城市的农贸市场以及中大型超市，采用无菌袋包装样品，逐一做好样品唯一性标识并分类，置于有温度监控装置的冷藏箱中，及时运至实验室冷冻保存，待检测分析。1.1.3 实验所用试剂菌株配套用培养基与选择性试剂（如3%氯化钠碱性蛋白胨水等）购自北京陆桥技术股份有限公司；病原微生物显色鉴定培养基等微生物鉴定用培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；P C R 预混液及耐热D N A 聚合酶等购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸抽提试剂盒与样品核酸消化裂解液等购自凯杰企业管理（上海）有限公司。1.2 仪器和设备A B I 7 5 0 0 实时荧光定量P C R 检测系统，购自美国应用生物系统公司（A B I）；全自动核酸蛋白分析测定仪，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司（B I O-R A D）；型生物安全柜，购自贝克中国有限公司（B a k e r）；全自动微生物生化药敏鉴定系统，购自生物梅里埃中国有限公司（B i o m e r i e u x）；小型桌面式冷冻高速离心机以及金属水浴锅购自艾本德中国有限公司（E p p e n d o r f）。1.3 方法1.3.1 预增菌将副溶血性弧菌标准菌株以及各对照菌株均接种于各菌株相对应的预增菌培养基中，置于3 6 培养1 2 h。冷冻水产品等样品分别称取2 5 g，加入至2 2 5 m L对应培养基中，用拍击式均质器均质混匀3 m i n，将样品充分分散后制备成样品悬浮液，3 6 培养1 2 h。1.3.2 D N A 提取制备在预增菌之后，将样液充分摇匀，使用移液器准确吸取1.5 m L 样品预增菌液至离心管中，作为检验材料进行D N A 制备与提取。在考虑制备D N A 的方法时，本文对比了两种比较常用的提取方法在冷冻水产品菌液D N A 制备中的应用效果。这两种方法分别为高温热裂解法和核酸亲和膜吸附法，两种方法的具体步骤如下：高温热裂解法：用移液器吸取冷冻水产品样品预增菌液1.5 m L，离心弃去上清，沉淀物加入1 0 0 LT E 缓冲液混匀溶解，1 0 0 条件下水浴孵育1 5 m i n后置于高速离心机上离心5 m i n。取上清液，稀释至D N A 溶液浓度为5 0 n g/L，作为P C R 工作液待用。核酸亲和膜吸附法：用移液器吸取冷冻水产品样品预增菌液1.5 m L，参照核酸抽提试剂盒说明书提取D N A。具体步骤如下：取样品预增菌液1.5 m L置于离心管中，加入3 0 0 L 核酸裂解液，振荡混匀3 0 s，置于7 0 水浴中温水浴7 5 m i n；温水浴后向论文福建轻纺 2 0 2 3 年3 月 第3 期论文江凤玲：冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光P C R 检测方法研究离心管中加入R N A 酶5.0 L，轻轻颠倒混匀5 次，之后置于3 7 水浴中温水浴2 5 m i n；温水浴后取出离心管加入2 0 0 L 蛋白沉淀液，1 3 0 0 0 r/m i n 离心3 m i n；离心后过膜，最后用T E 缓冲液洗脱D N A，该纯化的D N A 溶液稀释至1 5 0 n g/L，作为P C R 工作液待用。将所提取得到的样液D N A 做好唯一性标识，置于冰箱中冷藏保存，备用。1.3.3 引物与探针的设计与合成通过N C B I 数据库检索副溶血性弧菌等细菌基因组序列，根据基因组序列设计特异性的引物探针，具体信息见下表1。1.3.4 实时荧光P C R 反应体系与反应参数配置反应体系：在5 0 L P C R 体系中，加入含有镁离子的荧光P C R 反应预混合液2 5 L，上、下游引物各2.0 L，荧光探针1.0 L，样品抽提D N A 溶液3.0 L，用灭菌的蒸馏水将P C R 反应体系体积补充至5 0.0 L。仪器参数：一次循环（9 4 ，1 0 m i n；9 4 ，1 5 s；5 8.5 ，1 m i n），共进行4 3 次循环。2 结果及分析2.1 核酸提取结果分析本研究方法分别采用高温热裂解法以及核酸亲和膜吸附法提取样品预增菌液中的D N A，使用核酸蛋白分析仪进行分析检测。检测结果表明，高温热裂解法以及核酸亲和膜吸附法所提取的试样D N A 浓度在3 0 0 5 0 0 n g/L 之间，核酸纯度指标O D2 6 0/O D2 8 0的比值在1.6 0 1.8 0 之间，两种不同方法提取得到的试样预增菌样液D N A 的含量与纯度均可满足后续P C R 分析检测要求。综合考虑实验试剂成本以及时间成本，本研究后续选择采用高温热裂解法提取冷冻水产品试样中的D N A。2.2 方法特异性实验为了验证方法是否能特异性扩增副溶血性弧菌基因片段，对其他种病原菌是否也有扩增，同时为了防止交叉污染，本研究将提取得到的标准菌株D N A 采用实时荧光定量P C R 检测仪开展方法特异性验证工作。表1 引物和探针序列信息荧光标记探针5 H E X3 B H Q5 F A M3 B H Q5 R O X3 T A M R A5 F A M3 T A M R A5 H E X3 T A M R A5 R O X3 B H Q5 H E X3 B H Q检测基因副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌单核细胞增生李斯特氏菌大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7蜡样芽胞杆菌阴沟肠杆菌引物与探针序列（5-3）G C G A C C T T T C T C T G A A A T A T T A A T T G TC A T T C G C G T G G C A A A C A T CH E X-C G C A C A A G G C T C G A C G G C T G A-B H QT T C T T C A C G A C T A A A T A A A C G C T C AG G T A C T A C T A A A G A T T A T C A A G A C G G C TF A M-C A G A A C A C A A T G T T T C C G A T G C A A C G T-B H QG C G G C G T T G G A G A G T G A T AA G C A A T G G A A A A A G C A G G A T GR O X-C A T T T C T T A A A C G G C G G T G T C T T T C C C T-T A M R AC T G A A T C T C A A G C A A A A C C T G G TC G C G A C C G A A G C C A A C T AF A M-A T A C G A T A A C A T C C A C G G C T C T G G C T G G-T A M R AT C C T C A G C T A T A G G G T G C T T T T GA T C G A A A C A A G G C C A G T T T T T T A CH E X-T A T T T T T C C G