壳寡糖改善HepG2细胞胰岛素抵抗作用及机制研究_刘朋.pdf

食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES322023 Vol.49 No.5(Total 473)DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 032124引用格式:刘朋，李恒，龚劲松，等 壳寡糖改善 HepG2 细胞胰岛素抵抗作用及机制研究 J 食品与发酵工业，2023，49(5):32 37LIU Peng，LI Heng，GONG Jinsong，et al Ameliorative effect and mechanism of chitooligosaccharides on insulin resistance ofHepG2 cells J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):32 37壳寡糖改善 HepG2 细胞胰岛素抵抗作用及机制研究刘朋1，李恒1*，龚劲松1，蒋敏1，许泓瑜2，许正宏2，3，史劲松1*1(糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江南大学 生命科学与健康工程学院，江苏 无锡，214122)2(粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心(江南大学)，江苏 无锡，214122)3(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)摘要壳寡糖(chitooligosaccharides，COS)是一种具有多种生物活性的低聚寡糖，该文探究了 COS 对 HepG2细胞胰岛素抵抗的影响作用。通过胰岛素诱导 HepG2 细胞建立胰岛素抵抗模型，评估 COS 及其单体组分(聚合度 2 4)对其缓解作用。结果显示，COS 显著提高产生胰岛素抵抗 HepG2 细胞的葡萄糖消耗量，促进其葡萄糖代谢。进一步评估不同聚合度的 COS 单体发现，壳二糖和壳四糖对胰岛素抵抗的肝细胞无显著改善效果，而壳三糖显著提高胰岛素抵抗 HepG2 细胞的葡萄糖消耗量。另外，COS 及壳三糖显著提高胰岛素受体(insulin re-ceptor，I)、胰岛素受体底物 1(insulin receptor substrate 1，IS-1)、葡萄糖转运蛋白 4(glucose transporter 4，GLUT4)蛋白水平，活化蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)以及改善相关基因转录水平。综上，COS 通过介导 Akt/GLUT4 通路改善 HepG2 细胞的胰岛素抵抗，壳三糖在促进糖代谢中表现最优。关键词壳寡糖;壳三糖;胰岛素抵抗;肝细胞;糖尿病第一作者:硕士研究生(史劲松教授和李恒副教授为共同通信作者，E-mail:shijs163 com;liheng jiangnan edu cn)基金项目:宁夏回族自治区重点研发计划项目(2020BFH02011);江苏省高校优秀中青年教师和校长境外研修计划项目收稿日期:2022-04-25，改回日期:2022-07-242 型糖尿病作为世界公共卫生难题，其发病率占糖尿病总发病率的 95%，严重威胁人类健康1 3。除胰岛细胞功能受损导致胰岛素分泌不足之外，因组织对胰岛素敏感性降低而引起的胰岛素抵抗是 2 型糖尿病发病的最根本原因4 5。胰岛素抵抗主要发生在肝脏、肌肉和脂肪等组织中，其中肝脏是摄取、合成及代谢葡萄糖的主要场所，其在维持机体血糖平衡中发挥着直接作用6。胰岛素抵抗不仅会进一步加剧胰岛细胞功能损害，引起骨质疏松、周围神经病变等并发症，而且还往往与非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝癌的发生发展息息相关5，7。壳寡糖(chitooligosaccharides，COS)是由海洋生物甲壳提取而成的低聚寡糖，其在抗炎、降血脂、提高免疫力及保肝等方面具有良好疗效8。COS 能够显著降低糖尿病小鼠血糖水平，改善胰岛细胞功能并抑制肠道对葡萄糖的摄取9，但作用机制并不完全明晰。鉴于 COS 的药理作用往往与其聚合度息息相关10。因此，本研究旨在探究 COS 及其组成单体对胰岛素诱导的 HepG2 细胞胰岛素抵抗的改善作用，为 COS 的降糖、保肝等生物活性应用提供理论依据。1材料与方法1 1材料与试剂HepG2 细胞由本实验室保存;COS(成分为壳二糖、壳三糖和壳四糖，占比分别为 28 4%、50 07%和21 53%)，扬州日兴生物科技股份有限公司;壳二糖、壳三糖、壳四糖标准品，青岛博智汇力公司;胰岛素、二甲双胍、DMEM 培养基及葡萄糖检测试剂盒，Sigma 公司;CCK-8 试剂盒，日本同仁化学;抗体胰岛素受体(insulin receptor，I)、胰岛素受体底物(insu-lin receptor substrate，IS-1)，Abcam 公司;磷酸化蛋白激酶 B(phosphate protein kinase B，p-PKB/p-Akt)、蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)、葡萄糖转运蛋白 4(glucose transporter 4，GLUT4)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，Cell Signaling Technology 公司。1 2主要仪器SpectraMaxM2e 多功能酶标仪，美国 moleculardevices 公司;T100 型 PC 分析仪、CFX96TMTouch 荧光定量 PC 分析仪，美国 Bio-ad 公司;Tanon 4800Multi 化学发光图像分析仪，上海天能科技公司。研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)331 3实验方法1 3 1细胞活力检测HepG2 细胞在含体积分数 10%血清和 1%青霉素-链霉素双抗的 DMEM 培养基中，于37、5%CO2的湿润环境中培养。HepG2 细胞(2 104个/孔)培养于 96 孔板中至完全贴壁后，更换添加待测药物(干预组)的新鲜培养基继续孵育 24 h，不添加药物的培养孔为对照组，无细胞的培养孔为空白组。然后，再次吸去每孔培养基，并用 pH 7 5 的 PBS 洗 3 遍后，加入含有 10%CCK-8 溶液的等体积无血清培养基，避光孵育 2 h 后于450 nm 波长下测 OD 值(n=3)。根据公式(1)计算细胞活力。细胞活力/%=干预组 OD 值 空白组 OD 值对照组 OD 值 空白组 OD 值100(1)1 3 2HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的建立HepG2 细胞(2 104个/孔)于96 孔板中培养贴壁后，更换不含或含不同浓度胰岛素(01 50 mol/L)的 DMEM 培养基，分别设为对照组和模型组，继续培养 24、36 或 48 h，无细胞的培养孔为空白组。漂洗 3遍后更换新鲜无血清培养基继续孵育12 h，检测培养基中葡萄糖含量及细胞活力情况(n=3)。葡萄糖消耗量按公式(2)计算。葡萄糖消耗量/(molL1)=c(空白)c(对照/模型)(2)1 3 3COS 对葡萄糖消耗量的影响参照 1 3 2 建立胰岛素抵抗模型，PBS 洗 3 遍并更换含有不同浓度 COS 或其组分的 DMEM 培养基继续培 养 24 h。低 剂 量 组 100 g/mL，高 剂 量 组200 g/mL，阳性组二甲双胍 2 mmol/L，对照组则给予相同体积的 DMEM 培养基。之后，更换无血清培养基继续孵育 12 h。取培养基上清液对其进行葡萄糖水平检测(n=3)。1 3 4T-PC 分析通过 TIzol 法提取细胞总 NA11，1 g 总 NA逆 转 录 为 cDNA，反 应 体 系:200ngcDNA，5 nmol/L 上下游引物，5 L SYB Green 混合物，并在 95、15 s，60、30 s 条件下运行 40 个循环。通过 T-PC 系统测定靶基因的相对表达水平，并用2(CT)方法进行分析。测定的目标基因为 I、IS-1、GLUT4、过氧化物酶体增生物激活受体-辅激活子-1(peroxisome proliferator activated receptor coacti-vator 1，PGC-1)、叉头转录因子 1(fork head tran-scription factor，Foxo1)、白细胞介素 6(interleukin，IL-6)和-肌动蛋白(-actin)(表 1)。表 1引物序列Table 1Primer sequences基因上游引物序列 F(5-3)下游引物序列(5-3)ICATCCGGGGATCACGACTGATCAGGTTGTAGAGGCCGAGTIS-1CCCAGGACCCGCATTCAAAGGCGGTAGATACCAATCAGGTGLUT4ATCCTTGGACGATTCCTCATTGGCAGGTGAGTGGGAGCAATCTPGC-1GCTTTCTGGGTGGACTCAAGTGAGGGCAATCCGTCTTCATCCFoxo1TCGTCATAATCTGTCCCTACACACGGCTTCGGCTCTTAGCAAAIL-6ACTCACCTCTTCAGAACGAATTGCCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-actinCATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACGAT1 3 5Western Blot 分析细胞重悬于添加了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液中，冰上涡旋10 s，静置1 min，反复操作3次。4、12 000 r/min 离心 20 min，取上清液，获得总蛋白。蛋白定量后，与 Loading buffer 混匀沸水浴10 min。蛋白通过 SDS-PAGE 分离后，凝胶迅速转移到聚偏氟乙烯膜上，并进行电转。封闭 2 h 后，一抗4 孵育过夜。洗涤缓冲液荡洗 3 遍后二抗室温孵育 1 2 h，通过化学发光法对目标蛋白显影，并通过image J 软件定量分析。1 4统计学分析数据用平均值 标准差表示，采用单向方差分析法进行分析，通过 GraphPad Prism 5 软件作图分析。P 0 05 为具有显著性差异。与对照组比较，#P 0.05，#P 0.01，#P 0.001，与模型组比较，*P 0.05，P 0.01，P 0.001，ns 为无统计学差异。2结果与分析2 1HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的建立高浓度胰岛素刺激是建立胰岛素抵抗模型的常用方法之一，如图 1-a 所示，50 mol/L 胰岛素孵育细胞24 h 即能够显著降低其葡萄糖消耗量(P 0.05);在刺激 36 h 和 48 h 后，5 mol/L 胰岛素也能够明显抑制 HepG2 细胞的葡萄糖消耗量(P 0 05)(图 1-b，图 1-c)。同时，为了评估胰岛素对 HepG2 细胞的毒性作用，通过 CCK-8 法检测细胞增殖情况，如图 1-d所示，孵育 24 h 时，胰岛素刺激无细胞毒性(P 0.05);孵育36 h 时，50 mol/L 胰岛素显著引起细胞毒性(P 0 05)(图 1-e);图 1-f 显示，孵育 48 h 时，10 和 50 mol/L 的胰岛素均可以明显引起细胞毒性(P 0 05)。综合考虑，选择 5 mol/L 胰岛素对HepG2 细胞刺激 36 h 为诱导胰岛素抵抗的造模条件。食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES342023 Vol.49 No.5(Total 473)a 胰岛素刺激细胞 24 h 葡萄糖消耗量;b 胰岛素刺激细胞 36 h 葡萄糖消耗量;c 胰岛素刺激细胞 48 h 葡萄糖消耗量;d 胰岛素刺激细胞 24 h 细胞存活率;e 胰岛素刺激细胞 48 h 细胞存活率;f 胰岛素刺激细胞 36 h 细胞存活率图 1HepG2 细胞的胰岛素抵抗模型建立Fig 1Establishment of insulin-resistant HepG2 cell model2 2COS 对 HepG2 细胞增殖活性影响为探究 COS 对 HepG2 细胞的毒性作用，CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，COS