快速测定果蔬中维生素C含量实验教学改革_董楠.pdf

第 51 卷第 2 期2023 年 1 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.2Jan.2023快速测定果蔬中维生素 C 含量实验教学改革董 楠1,曹颖男2(1 广州新华学院医学公共课教学研究部,广东 广州 510520;2 广州新华学院药学院,广东 广州 510520)摘 要:维生素 C(Vc)含量测定是生物化学教学常规实验项目,但因 Vc 不稳定,如测试过程时间较长容易导致 Vc 被氧化进而影响实验结果,采用酶标仪检测法对柚子汁中 Vc 含量进行测定,结果表明,酶标仪法测得 Vc 含量为 278 mg/100 mL,远高于传统分光光度法(126 mg/100 mL)和碘量法(81.0 mg/100 mL),并且酶标仪法测试速度快,结果准确,操作简单,有助于提高学生的科研实验技能,适用于在本科实验教学过程中普及推广。关键词:实验教学;酶标仪;检测;维生素 C中图分类号:Q5-33 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)02-0264-04 基金项目:2020 年中山大学新华学院教学质量与教学改革工程项目(2020J067)。第一作者:董楠(1983-),女,硕士,实验师,主要从事生物化学实验教学及实验室管理。通讯作者:曹颖男(1983-),女,博士,副教授,主要从事中药及天然药物对肿瘤及炎性相关疾病的药理作用及机制研究。Exploration on Experimental Teaching for Rapid Determination ofVitamin C Content in Fruits And VegetablesDONG Nan1,CAO Ying-nan2(1 Faculty of Medical Public Courses,Guangzhou Xinhua University,Guangdong Guangzhou 510520;2 School of Pharmacy,Guangzhou Xinhua University,Guangdong Guangzhou 510520,China)Abstract:Measurement of vitamin C(Vc)content is a routine experimental item in Biochemistry teaching.It is easyto cause Vc to be oxidized due to its instability when the test process lasting for a long time,which affects the experimentalresults.Vc content in grapefruit juice was determined by a new microplate reader.The results showed that Vc contentdetermined by microplate reader was 292 mg/100 mL,which was much higher than that determined by traditionalspectrophotometry(126 mg/100 mL)and iodimetry(81.0 mg/100 mL).Moreover,the microplate reader method wasfast,accurate and easy to operate,which was helpful to improve students scientific research and experimental skills,andwas suitable for popularization in undergraduate experimental teaching.Key words:experimental teaching;microplate reader;detection;vitamin C维生素 C 又称抗坏血酸,是人体必需的微量元素,对人体具有增加免疫力,抗过敏,预防感冒及病毒细菌感染等重要作用1-3。Vc 在人体内不能自身合成,需从日常饮食中摄入,多存在于新鲜的果蔬中,因此有效快速的检测果蔬中 Vc 的含量就显得尤为重要4-5。随着分析方法和检测手段的不断发展,测定 Vc 含量的方法也越来越多。目前,主要有光谱法、容量法、色谱法、电化学分析法等几大类方法6-10。Vc 含量的测定是医药类专业本科实验教学的常规项目之一,根据实验方法可操作性、操作难易程度、仪器成本、试剂安全等方面综合考虑,我校药学专业开设的生物化学实验采用铜离子氧化法和碘量法两种方法测定维生素 C 含量,但因实验操作时间较长,Vc易受空气氧化进而导致测试结果普遍偏低,鉴于此,通过将科研型仪器酶标仪引入本科实验教学过程中,采用酶标仪检测法能够快速测定柚子汁中 Vc 含量,提高实验效率,培养学生科研创新能力,实验教学效果良好。1 实验教学设计依据因酶标仪法与紫外分光光度法测试原理相似11,故将铜离子氧化法中制备的样品在原来紫外法测试的基础上增加酶标仪法,并将两种方法测试结果进行比较,同时结合碘量法,在测试速度、实验结果准确性、学生操作难以程度以及实验态度等方面对两种实验方法进行综合比较分析,体现酶标仪检测技术在本科实验教学过程中的优越性。2 实 验2.1 主要仪器SpectraMax iD3 型酶标仪,美谷分子仪器有限公司;TU-第 51 卷第 2 期董楠,等:快速测定果蔬中维生素 C 含量实验教学改革265 1810DPC 型紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;HH-ZK8 型恒温水浴锅,郑州英峪予华仪器有限公司;移液器,上海宝予德科学仪器有限公司;涡旋混合仪,艾卡广州仪器设备有限公司等。2.2 材料与试剂(1)新鲜柚子(白肉);(2)0.2 mg/mLVc 标准溶液:20 mgVc 对照品,加适量蒸馏水溶解,然后用 100 mL 容量瓶定容,存于 4 冰箱中备用;(3)5 g/mL 的铜离子溶液:先配成1000 g/mL 的硫酸铜溶液,取上述硫酸铜溶液 5 mL,加入1 mol/L 的醋酸溶液 7 mL 及 1 mol/L 醋酸钠 200 mL,用蒸馏水定容至 1000 mL;(4)510-4mol/mL 的 EDTA 溶液;(5)铜离子-EDTA 混合溶液:使用前将上述铜离子溶液和 EDTA 以4 1(体积比)混合而成(pH 6.0,现用现配);(6)0.5%淀粉;(7)0.01 mol/L 标准碘溶液;(8)2 mol/L 醋酸。2.3 实验方法2.3.1 铜离子氧化法(1)标准曲线制作取标准 Vc 溶液 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 依次放入 1 6 号试管中,再依次向各管中加入蒸馏水至总体积为1 mL,则各管 Vc 的浓度分别为 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL,再向每个试管中加入 5mL 铜离子-EDTA 混合溶液,混合均匀,在波长 267 nm 处测试吸光度值,以标准 Vc 浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。(2)样品制备取一块柚子,剥皮,剩下的柚子肉用纱布挤出约 80 mL 的柚子汁,装入离心管中,在 3000 r/min 下离心 10 min,取上清液1 mL 稀释10 倍。取 1 mL 样品稀释液放入7 号试管中,加入5 mL 铜离子-EDTA 混合液(pH6.0)混匀后于波长 267 nm 处测定其吸收值,即为 J1值。另取1 mL 样品稀释液放入8 号试管中,再加入 4 mL 铜离子溶液,于50 水浴中加热15 min,破坏所有 Vc,然后加入 EDTA溶液1 mL,混匀后于波长267 nm 处测定其吸收值,即为 J2值。Vc 含量=NJ/S(1)式中:N 为样品稀释倍数;J=J1-J2;S 为标准曲线斜率。(3)样品测试图 1 加样模板Fig.1 Sample adding template采用紫外分光光度计和酶标仪分别对样品进行吸光度测试,并根据公式(1)分别计算出两种测试方法测得的 Vc 含量。酶标仪操作过程中,为规范学生的操作,每两组学生使用同一个酶标板进行测试并规定两组学生加样模板如图1 所示,每组学生每个样品各取200 L 放入对应的酶标板孔中,每个样垂直做三个平行样,圆心点孔为空白样,即为标准样的 1 号样品;灰色孔为标准样1 6 号样,黑色孔为未知样7 和8 号样。酶标仪软件操作设置界面如图 2 所示,因两组数据同时测,两组样品不可设置同一份空白样,故需每组样品单独设置。此时标准样和未知样所要扣减的空白样需分开设置,即设置两组空白样,每组学生的样品标准样即酶标板中第 5 8 行扣减第 1 行空白样,未知样即 9 10 行扣减第 2 行空白样,如图 2 所示。图 2 酶标仪设置加样模式Fig.2 Sample adding mode set for microplate reader2.3.2 碘量法按照步骤 2.3.1 中方法制备柚子汁上清液约 80 mL,精密吸取 20 mL 于 250 mL 锥形瓶中,加入 80 mL 蒸馏水,加入2 mol/L 醋酸溶液1 mL,0.5%淀粉溶液3 mL,混合均匀后,用0.01 mol/L 的标准碘溶液滴定,至呈现稳定的蓝色,在半分钟内不褪色,即为终点,做平行三份,计算柚子汁 Vc 的含量(mg/100 mL)。Vc 含量=VI2CI2MVC100VVC(2)3 结果与讨论3.1 铜离子氧化法Vc 在波长 243 267 nm 处有较高的吸收值。但在样品成分比较复杂时因有强烈的背景吸收而不适宜用紫外法直接测定其含量。利用铜离子消除背景误差,能准确地测定样品中的 Vc,而不需要进行前处理,操作简单,干扰少12-13。3.1.1 紫外分光光度计法测试结果表 1 紫外分光光度法测 Vc 含量数据结果Table 1 Data result of Vc content measured by ultravioletspectrophotometry样品标准 Vc 浓度/(mg/mL)A10020.020.06330.40.20640.060.32850.080.46060.10.57670.92680.169266 广 州 化 工2023 年 1 月图 3 紫外分光光度法测试 Vc 含量标准曲线Fig.3 Standard curve for measuring Vc content byultraviolet spectrophotometry紫外分光光度法测试的样品吸光度值如表 1 所示,标准曲线及线性方程如图 3 所示,显示出良好的线性关系,将数据代入公式(1)中求得柚子中 Vc 的含量为 126 mg/100 mL。3.1.2 酶标仪法测试结果酶标仪检测数据结果如表 2 所示,每个样品平行测 3 组取平均值后,以维生素 C 的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标做标准曲线,标准曲线方程和 R2值如图 4 所示,显示出良好的线性关系。同时酶标仪测试结果可显示出样品的标准偏差(SD)值和相对标准偏差(CV)值,SD 值在 0.001 0.013 之间,CV值个别样品偏大,酶标仪是微量操作,可能因操作不规范造成平行样的偏差,尤其 1 号样品因其是测得数值减去空白样品后的值,故可能会出现微小数值。其余样品 CV 值基本小于 5%,说明样品测试准确度较好。将 J1和 J2的均值代入公式(1)中,计算柚子汁中维生素 C 的含量为 278 mg/100 mL。表 2 酶标仪法测 Vc 含量数据结果Table 2 Results of Vc content data measured by microplate reader method样品标准 Vc 浓度/(mg/mL)A1A2A3A均SDCV/%10-0.00