江西一例iVDPV病例Ⅲ型脊髓灰质炎病毒基因特征分析_郭琴.pdf

第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023江西一例 iVDPV 病例型脊髓灰质炎病毒基因特征分析郭琴1，2，刘晓庆3，肖芳3，祝双利1，王东艳1，赵鹤鹤1，路环环1，肖金波1，杨倩1，李晓嫘1，朱晖1，冀天娇1，王雯慧4，何云4，孙强1，张勇1，5，许文波1，5，严冬梅1*（1.国家脊髓灰质炎实验室 世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室 国家卫生健康委员会生物安全重点实验室 国家卫生健康委员会 医学病毒和病毒病重点实验室 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 102206；2.达州中医药职业学院，达州 635000；3.江西省疾病预防控制中心，南昌 330029；4.山东第一医科大学，济南 271016；5.中国科学院 生物安全大科学研究中心，北京 102206）摘要：分析江西一例免疫缺陷患者体内连续采集的 15份粪便标本中分离到的 III型脊髓灰质炎病毒的全长 VP1区基因特征。将从 15份标本中分离到的 14株 III型 iVDPVs进行噬斑纯化，每个病毒随机挑取 10个噬斑，接着进行逆转录聚合酶链反应扩增，测定获取到的 154株 iVDPVs全长 VP1区序列。通过系统发育分析和 BEAST 程序探究iVDPV 病毒的进化特征，估算其进化速率和口服脊灰减毒活疫苗（attenuated oral polio vaccine，OPV）初始感染时间。14 株 iVDPVs 与 III 型脊髓灰质炎减毒疫苗株（Sabin III）核苷酸和氨基酸同源性分别为 97.8%98.7%和97.6%98.3%。相较于 Sabin III，14株 iVDPVs VP1区第 54位氨基酸发生了 AV 的突变，这可能导致温度敏感表型和衰减表型的改变。根据拓扑结构系统发育树被划分为 3个 Lineages，其中 1704918，1704922和 1704929分别属于 Lineage 1和 Lineage 2，其余属于 Lineage 3。具有 Lineage 3序列特征的克隆是优势克隆，呈现出随时间持续分化的特征。BEAST 程序估算的 14株 iVDPVs全长 VP1区核苷酸平均进化速率为 9.29103/位点/年（95%置信区间：2.811031.59102），OPV 初始感染时间为 2012 年 11 月 18 日。MCC 树（maximum clade credibility tree）显示前 4个遗传分支的分化仅用了 40 d。14株 III型 iVDPVs具有高度相关性，它们感染患儿后进化非常迅速，在慢性感染的早期便开始了谱系的分化。突变的不断积累和关键位点的改变可以引起 iVDPVs神经毒力的变化，导致患儿出现 AFP 症状。iVDPV 病例持续的排毒给脊灰根除目标的实现带来了巨大挑战，在脊髓灰质炎消灭的最后阶段及时调整免疫策略，继续维持较高的免疫覆盖率，保持 iVDPV监测的灵敏性显得十分重要。关键词：脊髓灰质炎病毒；免疫缺陷；口服脊灰减毒活疫苗中图分类号：R373.2 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02046809DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004279脊髓灰质炎（脊灰）病毒是小 RNA 病毒科肠道病毒的成员之一，包含 I、III三个血清型，具有与肠道病毒相似的基因 结 构。其 基 因 组 全 长 约7 500bp，由 一 个 单 一 开 放 阅 读 框 架（Open reading frame，ORF）、非编码区（Untranslated region，UTR）和 非 编 码 区（Untranslated region，3UTR）组成1。多聚蛋白前体可水解为P1、P2和 P3蛋白前体，然后分别进一步切割成 VP1VP4、2A2C 和 3A3D2。由于脊灰病毒 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）缺乏自我校正功能，导致脊灰病毒具有高度可变、适应性强和快速进化的特征3，4。人类是脊髓灰质炎病毒的唯一自然宿主5。脊髓灰质炎病毒主要感染 16 岁儿童，通过侵犯脊髓前角运动神经元，引发脊髓灰质炎等相关疾病，甚至造成婴幼儿肢体瘫痪、终身残疾和死亡。口服脊灰减毒活疫苗（Attenuated oral polio vaccine，OPV）的广泛使用使野生脊髓灰质炎病毒引起的脊髓灰质炎总发病率下降了 99.9%6，7。目前世界仅有野生脊髓灰质炎病毒（Wild poliovirus，WPV）血清型 I型仍收稿日期：20220728；接受日期：20221101基金项目：国家重点研发计划（项目号：2021YFF0703801），题目：微生物科学数据整合标准及共享服务平台建设；国家重点研发计划（项目号：2021YFC2302003），题目：病毒监测网络数据标准及数据平台建设；北京市自然科学基金（项目号：L192014），题目：EVA71 疫苗大规模应用后对我国手足口病病原谱的影响及其保护效果评价研究作 者 简 介：郭 琴（1993），女，从 事 公 共 卫 生 研 究，Email：GQ通讯作者：严冬梅（1976），女，研究员，主要从事肠道病毒分子病毒学研究，Email：开放科学（OSID）2期郭琴，等.江西一例 iVDPV病例型脊髓灰质炎病毒基因特征分析在阿富汗和巴基斯坦的少数地区流行8。型和 III型野生脊髓灰质炎病毒相继于 2015 和 2019 年宣布根 除9，我 国 也 早 于 2000 年 被 世 界 卫 生 组 织（WHO）认证为无脊灰状态。虽然 OPV 在全球脊髓灰质炎根除行动中发挥了不可磨灭的作用，但 OPV属于减毒活疫苗，在极少数情况下，它仍可能诱发疫苗 相 关 的 麻 痹 性 脊 髓 灰 质 炎（Vaccine associated paralytic Poliomyelitis，VAPP），或演变为疫苗衍生脊 髓 灰 质 炎 病 毒（Vaccine derived Poliovirus，VDPV）。其 中 VDPV 包 括 循 环 的 VDPVs（Circulating Vaccine derived Poliovirus，cVDPV）、免疫缺陷相关的 VDPVs（Immunodeficiency Vaccinederived Poliovirus，iVDPVs）和 不 能 确 定 来 源 的VDPVs（Ambiguous Vaccine derived Poliovirus，aVDPVs）10，11。在疫苗覆盖率较低的地区，这些VDPVs 可 能 会 出 现 并 传 播12，其 毒 力 可 相 当 于 WPV13，14。免疫缺陷患者接种 OPV 后，由于自身免疫功能异常无法对疫苗病毒产生免疫应答导致疫苗病毒在体内长期存在、复制和排泄，当排泄的型和 III 型病毒 VP1 区基因有1%（型病毒0.6%）变异时称为 iVDPVs15，16。iVDPVs虽然很少发生，但由于与 cVDPVs 在分子病毒学上无本质区别，持续的复制和回复突变可以使其获得较高的神经毒力和较强的传播力6，因此在消灭野脊灰病毒和停止使用脊灰疫苗后长期排泄的 iVDPVs很有可能再将脊灰引入社区，给全球脊髓灰质炎病毒的根除埋下巨大的隐患17。据报道，自 1961 年第一例 iVDPV 报告以来，已在非洲、欧洲、地中海东部、美洲、东南亚、西太平洋等多个地区发现了 149 例 iVDPV 病例11，cVDPVs 疫情也在非洲、中东和亚洲的偏远地区不断暴发。而我国在近 20 年时间里也先后在 11 个省发现了 12 例 iVDPV 病例。此外，由于原发性免疫缺陷（PID）患者的生存率较低，以及缺乏 iVDPV 病例的监测，全球慢性 iVDPV 排泄者的数量很可能被低估18。2013 年，我们从江西省的一例 iVDPV 病例的15份粪便标本中分离到 14株 III型脊灰病毒。为了更加深入了解这些 iVDPVs 的分子生物学特征，本文测定了 14 株 III 型脊灰病毒全长 VP1 序列，对其基因特征、系统进化及 OPV 初次感染时间进行了分析，这些发现将加深我们对 iVDPVs的认识，为我国乃至全球脊灰的根除提供有价值的参考。材料与方法1 病例概况患儿 7 月龄，男，居住于江西宜春市樟树市，2012 年 10 月 7 日出生，接种 OPV 三剂，最后一次服苗时间为 2013年 2月 20日。2013年 5月 19日，患儿出现麻痹症状，随即就医治疗，经检测患儿免疫功能低于正常，被诊断为 iVDPV 病例。2013 年 5 月 30日至 2014年 4月 12日，每月采集患儿粪便标本进行检测。最终患儿持续排毒 11 个月后不幸于 2014 年4月 18日死亡。2 病毒鉴定及分离该病例的 15 份粪便原始标本由江西省疾病预防控制中心脊灰实验室进行病毒分离和血清定型。接着我们严格按照世界卫生组织（WHO）脊灰实验室手册 第 4 版的操作标准将获取到的病毒接种到人横纹肌肉瘤细胞（Human rhabdomyosarcoma，RD）中进行病毒分离，在观察到完全肠道病毒样细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）后，收集阳性的细胞培养物。病毒分离使用的 RD 细胞由美国疾病预防控制中心提供。3 病毒噬斑克隆纯化按照国家脊灰实验室病毒噬斑纯化实验操作标准，将分离到的 14 株脊灰病毒的稀释液 107、108分别接种到覆有单层 RD 细胞的培养皿中，加以琼脂培养基进行固定，待噬斑形成后，每个病毒随机挑取10 个 独 立 的 噬 斑，再 将 收 集 到 的 噬 斑 进 行 病 毒分离。4 全长 VP1区核苷酸序列测定首 先 使 用 QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）试剂盒提取 14株原始分离株和 140株噬斑纯化后的病毒核酸。核酸提取物用 One Step PrimeScript RTPCR Kit（Perfect Real Time，TaKaRa，Dalian）进行肠道病毒特异性荧光定量聚合酶链反应技术（Realtime polymerase chain reaction，RealTime PCR）检测，接着将荧光定量 PCR 检测阳性的核酸提取物进行逆转录聚合酶 链 反 应（Reverse transcript polymerase chain reaction，RTPCR）以扩增完整的 VP1编码区序列，扩增引物为：UG1：TTTGTGTCAGCGTGTAATGAUC11：AAGAGGTCTCTATTCCACAT然 后 使 用 QIA quick PCR Purification Kit 469病 毒 学 报39卷（QIAGEN，Hilden，Germany）对 PCR 产 物 进 行 纯化，最 后 使 用 ABI 3130 遗 传 分 析 仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）进行双向测序，以获取整个 VP1区序列。5 系统进化分析使 用 Sequencher5.0.5 软 件（GeneCode，Ann Arbor，Michigan，USA）整理拼接测序所获得的 154条全长 VP1 序列。使用 MEGA7.0（Sudhir Kumar，Arizona State University，Tempe，Arizona，USA）软件中的 ClustalW 工具比较 14 株原始分离株与Sabin III 疫苗株核苷酸和氨基酸的差异。接着从140株噬斑纯化后的脊灰病毒中筛选出具有不同变异的 34 条序列（相同变异序列不重复纳入）进行系统进化分析。通过 Find Best Models 程序选择了最佳的核苷酸替代模型“K2”，然后采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）在 MEGA7 中构建