SNT 1377-2004 从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N f T 1 3 7 7-2 0 0 4从精液中分离马病毒性动脉炎病毒 试验操作规程P r o t o c o l o f t h e i s o l a t i o n o f e q u i n e v i r a l a r t e r i t i s v i r u s f r o m s t a l l i o n s s e me n2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 3 7 7-2 0 0 4前言本标准的附录A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国山东出人境检验检疫局.本标准主要起草人:梁成珠、朱来华、王树锋、王丽。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 3 7 7-2 0 0 4从精液中分离马病毒性动脉炎病毒 试验操作规程范围本标准规定了从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验方法。本标准适用于从精液中分离马病毒性动脉炎病毒。2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。1 E A V:马病毒性动脉炎病毒。Z ME M:含非必需氨基酸的细胞培养液。仪器设备么233.1 超净工作台或生物安全柜。3.2 二氧化碳培养箱。3.3 倒置显微镜。3.4 液氮贮存罐。3.5 蔡氏滤器和微孔滤膜(0.2 2 ja m),3.6 蒸汽消毒器。3.7 微量细胞培养板(9 6 孔)。3.8 微型振荡器。3.9 可调微量移液器和吸嘴(2 0 0 K L),3.1 0 电子天平(0.1 m g-2 0 0 g),3.1 1吸管(1 mL,2 mL,5 mL,1 0 mL),试剂4.1 抗生素贮存液。4.2 7.5%碳酸氢钠溶液。4.3 细胞消化液(0.0 2%E D T A)。4.4 标准病毒株和细胞系:一1 9 6 C(液氮)冻存备用。4.4.1 标准病毒株:马病毒性动脉炎病毒(E q u i n e A r t e r i t i s V i r u s,E A V)B u c y r u s 株。4.4.2 细胞系:兔肾细胞(R K-1 3),4.5 细胞培养液和细胞维持液。4.6 1%细胞染色液。4.7 7.5%梭甲基纤维素。5操作方法精液 采集 准备干净、无菌的采精管(如假阴道、阴茎套)。采精管不得含有防腐剂或消毒剂。S N/T 1 3 7 7-2 0 0 45.1.2 采集精液时可同时采两份，也可在不同时间各采一份，应采集含精子量多的部分(射精中期)作为待检样品进行病毒分离。5.1.3 采精后，应立即将含精液的采精管放人碎冰中或冰盒中，尽快送到实验室。如果不能及时送实验室，可将精液暂时冷冻于一2 0 以下保存(不超过 7 d)，冷冻精液不影响病毒的分离。5.2 病毒分离5.2.1 将精液进行预处理，超声波裂解三次，每次1 5 S.5.2.2 在 4 下1 0 0 0 g 离心 1 0 m i n，沉淀精子细胞。5.2.3 上清液用维持液做 1 0-1-1 0-3系列稀释，接种于已长成单层的R K-1 3细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用 6 0 倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。5.2.4 加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层。5.2.5 在 5%二氧化碳恒温恒湿二氧化碳培养箱中孵育1 h.5.2.6 加人含 0.7 5 0 0 竣甲基纤维素的培养液，再培养。5.2.7 培养 2 d-6 d 后，在显微镜下观察 C P E情况(细胞圆缩、脱离、裂解)。5.2.8 如果不出现 C P E，应盲传一次，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养 5 d-7d后，用细胞染色液(工作液为。.1%福尔马林缓冲结晶紫溶液)染色。5.2.9 用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。6结果判定 检查各种对照试验，细胞对照正常，无 C P E;阳性对照出现明显的 C P E，说明试验成立。如果试验组出现明显的C P E，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则判为病毒分离阳性;如果没有明显的C P E,结晶紫染色后，细胞单层出现细胞壁不完整的死细胞区域，也判为病毒分离阳性。如果分离的细胞培养物能被E A V阳性血清中和或其他方法，则分离的病毒为E A V.S N/T 1 3 7 7-2 0 0 4 附录A(规范性附录)试剂的配制A.1 抗生素贮存液 用灭菌蒸馏水配成每毫升含 1 0 0 0 0 l u青霉素和 1 0 m g链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜(0.2 2 p m)过滤除菌，分装成2 mL/瓶，一2 0 冻存备用。保存期不超过 6 0 d,A.2 7.5%碳酸氢钠溶液 7,5g 碳酸氢钠溶解于 1 0 0 m L蒸馏水，用微孔滤膜(0.2 2 p m)过滤除菌，分装成2 mL/瓶,4 冷藏备用。保存期不超过 6 0 d,A.3 细胞消化液(0.0 2%E D T A)E D T A(乙二胺四乙酸二钠:V e r s e n s e)(A.R.)0.2 g 氯化钠(A.R.)8.0 g 氯化钾(A.R.)。.2g 磷酸氢二钠(A.R.)1.1 5 g 磷酸二氢钾(A.R.)。.2g 加双蒸水至1 0 0 0 m L，充分溶解，分装成小瓶，1 1 5 高压灭菌 1 0 min,4 冷藏备用。保存期不超过 9 0 doA.4 细胞培养液和维持液 细胞培养液:含 1 0%灭能的无菌胎牛血清(F B S)的ME M培养基。细胞维持液:含2%灭能的无菌胎牛血清(F B S)的ME M培养基。细胞培养液和维持液均用微孔滤膜(0.2 2 p m)过滤除菌，分装成小瓶，4 冷藏备用。保存期不超过6 0 d。使用时加1%抗生素贮存液(终浓度为每毫升M E M培养基含1 0 0 1 U和1 0 0 u g)，并用7.5%碳酸氢钠溶液调 p H值至7.0-7.2.A.5 5%结晶紫贮存液 2 5 g 结晶紫粉溶解于4 7 5 mL纯乙醇，再定容至 5 0 0 mL，过滤除去结晶。A.6 1%细胞染色液 5%结晶紫贮存液 1 0 0 mL、生理盐水(0.8 5 氯化钠)3 7 5 mL、福尔马林(含4 0%甲醛)2 5 mL混匀，分装成 5 m L一瓶,4 保存备用。保存期不超过 9 0 d eA.7 5 梭甲 基纤维素 竣甲 基纤维素粉7.5 g 溶解于1 0 0 m L双蒸水，充分搅拌混匀，1 2 1 0C 高压灭菌 1 5 m i n，分装成5 mL 一瓶，4 保存备用。保存期不超过 3 0 d,