yyt 0127.10-2001 口腔材料生物学评价 第二单元-口腔材料生物试验方法——鼠伤寒沙门式杆菌回复突变试验（Ames试验）.pdf

YY/T0127.10-2001试管或菌种管内，经干冰丙酮液（一75）或液氮（一196）速冻，在一80冰箱或一196液氨中长期贮：存。5.3增菌培养从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37振荡(100次/min)培养1012h,活菌数应达10个/mL(或0D0.4)，细菌培养液从37C取出后，应立即放入冰浴中备用，试验需用当天孵育好的新鲜细菌。5.4菌株鉴定5.4.1组氨酸需求(his一)试验凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。鉴定方法：在底层培养基平皿表面加人0.5mmol/LL组氨酸0.1mL和0.5mmol/LD-生物素0.1L。用L棒铺开。对照平皿只加生物素不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液，在对照平皿和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上，经37C孵育24h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生长，在对照平皿上不应生长。5.4.2脂多糖屏璋缺陷鉴定(rfa突变)粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进入菌体内而抑制其生长。野生型菌株或含gl缺失的菌株则不受影响。鉴定方法：分别将每种细菌培养液0.1mL加到452mL顶层培养基试管内，混匀后倾倒于营养琼脂培养基平皿表面，使其均匀分布。待固化后，取直径为6mm无菌滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶液10L,放到平皿中央。经37孵育24h后，围绕圆纸片出现透明的抑菌环（直径大约14mm),说明此菌存在深粗型(rfa)突变。TA97、TA98,TA100、TA102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。5.4.3对紫外线敏感性鉴定(uvrB修复缺陷型的鉴定)具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。用黑纸覆盖平皿一半，在距离33cm处用15W紫外线杀菌灯照射平皿8s,经37孵育24h后观察结果。对紫外线敏感的菌株(TA97、TA98、TA100)只在未照射过的一半平皿上生长。而具有uvrB修复缺陷型的菌株(TA102)在紫外线照射（未盖黑纸的另一半平皿）后仍能生长。5.4.4抗氨苄青霉索(PKM101)试验（菌株R因子丢失鉴定）含R因子的试验菌株对氨苄青籍素具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性，赦需鉴定R因子是否存在。鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氨苄青霉素平皿表面平行划线，四株细菌可刘在同一平皿上。还应选用一个无抗性因子的药株，以测定氨苄青霉素的效应。经37孵育24h后，无抗性因子菌株不应生长。鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。将沾有氨苄背霉素溶液的滤纸条与划线交叉放置，37解育24h。如滤纸条周围细菌生长正常，说明试验菌株具有R因子。5.4.5四环素(PAQ1)抗性的鉴定鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氨苄青霉素/四环素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。经37孵育24h后，对四环素有抗性的TA102菌株能生长，对四环素无抗性的菌株不生长。鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细茵可划在同一平皿上。待干后，吸取四环素(8mg/mL)溶液与茵株刘线处交叉划线，37解育24h。对四环素有抗性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长。2