SNT 2693-2010 马焦虫病检疫规范.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 马焦虫病检疫规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犈 狇 狌 犻 狀 犲狆 犻 狉 狅 狆 犾 犪 狊 犿 狅 狊 犻 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 马巴贝斯虫病检测方法：微量补体结合试验方法。本标准与 相比，主要技术变化如下：增加了马焦虫病的血液涂片镜检；增加了间接荧光抗体试验；增加了酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、陈本龙、柴铭骏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犛 犖犜 马焦虫病检疫规范范围本标准规定了马焦虫病的血涂片镜检、间接荧光抗体试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等技术要求。本标准适用于马属动物的马焦虫病检疫、诊断和血清学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法概述参见附录。临床症状与病理变化参见附录。被检血清样品采集 采血和分离按常规方法采血和分离血清。血清应新鲜，无明显蛋白凝固、无溶血、无腐败气味。运送和保存防止血清冻结和受热，若内不能送到实验室，应采用冷藏方法运送。血清应放至冰箱内保存备用。实验室诊断 血涂片镜检 仪器和设备普通显微镜。试剂和材料 姬姆萨染色液，配制方法参见附录。犛 犖犜 载玻片：处理方法参见附录。操作步骤 血涂片制备无菌采集动物血液，取 滴于载玻片的一端约三分之一处，以一端边缘光滑的载波片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。将血涂片置空气中干燥，用铅笔在载玻片的标签上编号，注明制片日期。血涂片染色将制备好的血涂片 热固定 ，再用姬姆萨染液染 。染色后涂片用自来水冲洗次次，以除去附着的染料，但不能超过，否则样本会脱色。将血涂片空气干燥，先用低倍镜（如 ）观察，再用 倍油镜下观察红细胞内是否有马焦虫裂殖子。结果判定 若见红细胞内的裂殖子呈梨籽形，长，直径 ；成对裂殖子两尖端连接成锐角（参见附录），则可确诊此动物为驽巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。若见红细胞内裂殖子相对较小，长度小于，呈圆形或阿米巴样；成对的裂殖子尖端不连接，常成同端异向并列；通常个裂殖子组成四联体或马尔他十字形状（参见附录），则可确诊此动物为马巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。若未见有 和 所描述特征的裂殖子，则宜借助其他试验进一步确诊。间接荧光抗体试验 仪器和设备 台式离心机。冰柜：。磁力搅拌器。荧光显微镜。微量移液器。试剂和材料 溶液（）配制方法参见附录。山羊血清。丙酮，分析纯。阳性对照血清。阴性对照血清。配制方法见附录。荧光素标记的羊抗马 。真空管：容积 。载玻片。粘质纸带。锡箔纸。干燥缸。犛 犖犜 染色缸。指甲油。一次性注射器：规格为。型微量反应板。湿盒。操作步骤 抗原片制作 当已知感染马焦虫病动物红细胞染虫率达时，采集全血，冷藏方法送至实验室。将装有全血的真空管置台式离心机内，离心 ，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。向真空管中加入 溶液，用移液器轻柔地反复吹打沉积的红细胞层，至重新悬浮红细胞后，离心 ，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。依此法重复两次。用含有 山羊血清的 溶液重新悬浮红细胞，使血球沉积量占血球悬浮液总量的三分之一。即如果沉积的血球量为，则应加入含有 山羊血清的 溶 。取的红细胞悬浮液滴在载玻片的一末段。再拿另一载玻片，将其倾斜 角左右，慢慢地将红细胞液滴推向载玻片的另一段，使载玻片均匀地涂有一薄层血液，并将其置空气中晾干。即得抗原片。依此法制备若干抗原片，并用粘质纸带遮盖封贴涂有血液的那一侧载玻片。将若干封好的载玻片用锡箔纸包好，置 冰柜中保存备用。正式试验 依据试验所需从 冰柜中取出若干抗原片，将抗原片放置在带有干燥剂的干燥缸中，室温放置约 。小心地拿掉抗原片上封贴的粘质纸带。从 冰箱中取出丙酮，将其倒入染色缸中。将抗原片放进装有丙酮的染色缸中，固定。迅速取出抗原片，并用纸快速扇走抗原片上的丙酮。待抗原片自然干燥后，用一次性注射器取指甲油，将抗原片划成个约 的小方块，并置空气中约 至晾干。在微量反应板中，用含有山羊血清的 溶液将被检血清、阳性对照血清和阴性对照血清作、稀释。用微量移液器取 的稀释液滴加到抗原片上相应的小方块中，将其置湿盒中室温下感作 。用预冷至的 约 冲洗玻片后，将其放入装有 的染色缸中磁力搅拌洗玻片 。倒掉染色缸中的液体，重新加入 ，磁力搅拌洗 ，依此法共洗三遍。将玻片取出置空气中约 晾干。用含有山羊血清的 溶液将荧光素标记的羊抗马 作 稀释（抗体滴度高时，可增加稀释倍数），取 稀释液加入到各小方块中，并将其置湿盒中室温下感作 。犛 犖犜 重复 。将干燥好的玻片置荧光显微镜下观察。结果判定 阳性对照的判定阳性对照血清的小方块中可见强烈的特异性荧光。阴性对照的判定阴性对照血清的小方块中未见特异性荧光。被检血清的判定当对照成立时，可进行试验结果判定。当被检血清 或更高稀释度的小方块中可见特异性荧光时，则该被检血清判定为间接荧光抗体阳性。当被检血清的小方块中未见有特异性荧光时，则该被检血清判定为间接荧光抗体阴性。补体结合试验 仪器和设备 可调微量移液器。可调连续加样器。水平转子离心机。酶标仪。水浴箱。试剂和材料 蒸馏水：中的三级水。稀释液：灭菌生理盐水。阿氏液：配制方法参见附录。补体结合抗原：按说明书使用，使用前充分摇匀。强阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。弱阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。阴性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。溶血素：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。补体：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。绵羊全血：选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，阿氏液中加入 血，混匀，冰箱内保存后备用。玻璃试管：，圆底，洁净。试管架。孔“”型微量板。孔平底（）微量板。犛 犖犜 操作步骤 预备试验 绵羊红细胞悬浮液的制备 绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机 离心 ，最后一次离心 。取份下沉血泥加入到 份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬浮液。取出 红细胞悬浮液加入到 蒸馏水中，使红细胞充分破解，液体清亮。取 加入到平底微量板孔内，纵向加个孔。用酶标仪 下读 值，算出平均 值，代入校正红细胞浓度见式（）：犃（犅犆）犆（）式中：犃 稀释液加入量；犅 平均 值；犆 红细胞悬浮液量。取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬浮液中即得红细胞悬浮液。溶血素效价的测定 稀释溶血素取 溶血素原液，加入到 稀释液中，制成 稀释的溶血素，再按表稀释成不同稀释倍数的溶血素。如果溶血素是由等量甘油保存，则溶血素原液所需量加倍，并相应减少稀释液量。表溶血素的稀释稀释倍数溶血素量 生理盐水 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞取个试管，每管加 的红细胞悬浮液，然后分别缓慢加入不同稀释倍数的溶血素 ，混匀，水浴箱中感作 。溶血素效价的确定将补体原液预稀释至 ，按表进行测定。犛 犖犜 表溶血素效价测定试管号稀释液 补体 不同稀释液倍数致敏红细胞 溶血素稀释倍数 感作 水浴 （每间隔 振次）冷稀释液 将各管用水平转子离心机 离心 ，取上清液 分注平底微量板，下读 值。按公式（值 ）算出各管溶血度，在普通坐标纸上以溶血素的稀释度为横坐标，溶血度为纵坐标，绘制曲线，确定出现平高线的点，比此浓度高 的稀释度定为溶血素的工作效价（即为 倍，溶血素稀释倍数 溶血素工作效价）（参见附录）。制备致敏红细胞悬浮液按测定的溶血素效价稀释溶血素，缓慢加入到等量的绵羊红细胞悬浮液中，混合均匀，置 水浴箱中感作 。补体效价的测定补体预稀释至 ，做组重复管，按表进行测定。表补体效价测定试管号 补体 稀释液 第一次感作 水浴 致敏红细胞 第二次感作 水浴 （每间隔 振次）冷稀释液 将各管用水平转子离心机 离心 ，取上清液，下读 值，按公式（平均 值 ）计算出各管的溶血度（犢），在双对数坐标纸上以犢（犢）为横坐标，补体用量为纵坐标，制成一直线，找出 溶血时补体的用量（含个 单位），代入公式：补体稀释倍数 溶血时补体用量，即得出本试验补体工作效价（含 个 单位）（参见附录）。抗原效价的测定 阳性对照血清和阴性对照血清分别用稀释液作稀释，置 水浴箱中灭活 。将阳性对照血清作倍比稀释（见附录）。将抗原从作倍比稀释（见附录）。犛 犖犜 建立方阵试验：在“”型微量反应板中进行。用微量移液器分别取 血清、抗原、补体加入至微量反应板对应的孔内，振荡感作 ，取 致敏红细胞加入至每个孔内，振荡感作 ，同时设立血清对照、抗原对照、补体对照（见附录）。记录测定结果：取出微量反应板，水平转子离心机 离心 ，与标准比色孔（比色孔的配制见附录）比较，观察溶血度，记录结果。抗原效价的确定：在对照成立时，与阳性对照血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价，即为个单位抗原，本试验抗原使用个单位为其工作效价。正式试验 溶血素、抗原、补体按预备试验测定的工作效价稀释。在玻璃试管中将被检血清和强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清做稀释后，置 水浴箱中灭活 。将灭活后的血清在“”微量反应板中从开始进行倍比稀释。一般阳性对照血清做六个稀释度，阴性对照血清可做三个稀释度。被检血清在做筛选试验时一般作一个稀释度，在做确证试验时一般作六个稀释度。用微量移液器分别取 血清、抗原、补体加入至微量反应板对应的孔内，振荡感作 ，取 致敏红细胞加入至每个孔内，振荡感作 ，同时设立强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、血清抗补体对照、抗原对照、补体对照和红细胞对照（见表）。表血清效价的测定操作步骤血清试验孔 血清抗补体对照抗原对照补体对照 个补体单位 个补体单位 个补体单位红细胞对照血清 抗原 稀释液 补体 第一次感作 振荡 致敏红细胞 第二次感作 振荡 取出微量反应板，水平转子离心机 离心 ，比照标准比色孔，记录结果。结果判定 比照标准比色孔判读，达到 抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价。各对照的结果成立时，可进行判定。否则，补体的效价应重新测定，并重新做 试验。阳性对照的判定：阳性对照血清效价与已知效价或预测效价变化范围不超过一个滴度。阴性对照的判定：阴性对照孔 溶血。血清抗补体对照的判定：抗补体对照孔 溶血（如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相同说明该血清为抗补体）。犛 犖犜 抗原对照的判定：溶血。补体对照的判定：个单位补体对照孔 溶血，个单位补体对照孔部分溶血，个单位补体对照孔不溶血。红细胞对照的判定：不溶血。被检血清的判定：一般被检血清稀释以上达到 抑制溶血时判为阳性，小于 抑制溶血时判为阴性。竞争酶联免疫吸附试验 仪器和设备 可调微量移液器。洗板机。酶标仪。试剂盒组成 抗原包被板：基因重组抗原包被的 孔微量反应板。阳性对照血清。阴性对照血清。倍浓缩的一抗：与包被的抗原发生特异性结合的单克隆抗体。倍浓缩的二抗：辣根过氧化物酶标记的与一抗发生特异性结合的单克隆抗体。抗体稀释液。血清稀释液。倍浓缩的洗液。底物。终止液。材料 未包被抗原的微量反应板。加样槽。操作步骤 预备试验 试验前，血清样品、试剂和反应板均恢复到室温。在未包被抗原的微量反应板中，用血清稀释液将被检血清、阳性对照血清、阴性对照血清作稀释。其中阳性对照血清和阴性对照血清作双孔稀释，在大批量筛选试验中，被检血清可作单孔稀释。按照一抗工作浓度和试验所需量，将一抗用抗体稀释液作稀释。按照二抗工作浓度和试验所需量，将二抗用抗体稀释液作稀释。按照洗液的工作浓度和试验所需量，将洗液用蒸馏水作稀释。正式试验 加血清样品将已稀释好的被检血清、阳性对照血清、阴性对照血清用微量移液器移取 至抗原包被板对应犛 犖犜 的孔内