nyt 906-2004.pdf

NY/T906-20045.3.2.6IDNA分子量Markers采用1)60碱基对的I)八.1Mark.吸取0.5l.I:g/nl.Markers,加入7：l.I0l.琼脂糖凝胶指小缓冲液中5.3.3操作5.3.3.1提取样品RNA5.3.3.1.1固体组织将0.5g-1g组织放在平中，用尤南剪刀剪碎后，加入4ml.溶液D(附求B.2.2).放玻璃研磨器中磨成组织匀浆，放入12ml聚苯乙矫离心管中，加入1/10体积(0.4mL)2nl1.H4.2醋酸钠缓冲液混匀后冉加入等体积水饱和酚混匀5.3.3.1.2再加入15体积(0.8ml)氯仿-异戊醇溶液(49：1)，混匀10min,在冰浴中放置约20min.将上层水层吸人另一个清洁离心管中，加入2.5体积的无水乙醇，在-20至少淀2（或在-70沉淀1h),以I0000g离心10min沉淀RNA5.3.3.1.3吸弃【：清液后，将沉淀用70%乙醇洗涤儿次以除去残余的酚将盛行NA的离心管倒粉于真空罐中抽气5mim-10min,使RNA下燥5.3.3.1.4将十燥的RNA用2ml灭菌双蒸水溶解，并用260nm、280m测定RNA浓度和纯度如果260/280比值大于1.7，RNA浓度在0.5ng1mg之间，可用于下一步RTPK1比值小于1.7或RNA浓度过低，可如前再沉淀，直到达到要求。如果提取的RNA样品中蛋白质含量过高，即260/280比值小于1.7，则应将RV样品用蛋白酶进消化。5.3.3.1.5吸取2mL2mgml的蛋白酶溶液，加入2 mL RNA中，37消化1h-2h,加入等体积缓冲液饱和酚-氯仿混合液，充分混匀后，作用1h一2h,以880g900g离心10min,将上层水层吸入另-离心管中，加入2.5体积的无水乙醇，一20如前沉淀。以上方法也可用于从汨液和1腔棉拭子样品中提取RNA5.3.3.2提取外周血单核细胞(PI3MCS)RNA5.3.3.2.1对于10ml以上TA或肝索抗凝的外周血样品，以1300g室温(18：20)离心10min,吸取上层的淡黄色PBMSC层，重新悬浮于终体积为20ml的HBSS中5.3.3.2.2对于少于10ml.的样品取5ml.-10ml全血，加入HSS使终体积为20ml,混匀后，在血液底层加入10 mL Ficoll溶液以800g-900g室温离心30min,沉淀红细胞后吸取icol层顶部的清亮白1细胞层，转移到另一个50mL离心管中，加入8 ml.HBSS(附录3.2)，重新悬浮细胞，再加H3SS使体积达到40ml.45ml.混匀斤i,以500g离心10min,如此离心洗涤23次最后一次离心后将PM(S用HSS配成8ml.-10nmL细胞悬液。取样10l,州1：10苔酚蓝溶液染色后进活细胞计数。其余细胞悬液分装后-70或液氮保存，该样品也可用于进病分离培养5.3.3.2.3 PBMCS RNA提取取相当于至少5ml全血的洗涤M(S用1mLHS悬浮后，加入无南的1.5mL离心管中离心20nmin30nin,弃上清.加入0.4ml溶液I).按5.3.4.1.项提取RNA5.3.3.3RT-PCR操作程序5.3.3.3.1PCR引物第一对引物为PRV随合蛋门(F)基因特异性引物，序列如下：RPVE3 5 AAGAGGCTGTTGGGGAC6