NY-T 402-2000 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程.pdf

B1 5N.,中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 4 0 2-2 0 0 0脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s-f r e e s e e d(s e e d l i n g)s w e e t p o t a t o e s2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 发布2 0 0 0 一 1 2 一 0 1 实施中华人民共和国农业部发 布N Y/T 4 0 2-2 0 0 0前言 为了有效地实施对脱毒甘薯种薯(苗)质量检验和管理，规范脱毒甘薯种薯(苗)市场，促进甘薯脱毒技术推广，实现脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的规范化、标 准化，特制定本规程。本规程在参照国内外甘薯病毒检测技术最新研究进展的 基础上，结合当前国内生产实际，力求达到快速、准确、可操作性强的检测要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、危害性大的 病毒。检测方法主 要采用指示植物检测和斑点酶联免疫吸附检测方法。本规程内容包括脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的适用范围、检测对象、抽样方法、检测方法和质量要求。本标准的附录A、附录B都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准主要起草单位:农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试中心(济南)、山东省植物保护总站。本标准主要起草人:孙作文、商明清、李明立、刘敬东、杨勤民、任宝珍。中华人民共和国农业行业标准脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程N Y/T 4 0 2-2 0 0 0Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s-f r e e s e e d(s e e d l i n g)s we e t p o t a t o e s1 范围 本标准规定了脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测方法和 操作规程。本标准适用于脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测。2 定义 本标准采用下列定义。2.1 脱毒苗 应用茎尖组织培养技术获 得的再生试管苗，经检测确认不带甘薯羽 状斑驳病毒(S P F M V)和甘落潜隐病毒(S P L V)，才确认是脱毒苗。2.2 脱毒种薯(苗)从繁殖脱毒苗开始，经 逐代繁殖增加种薯(苗)数量的种薯(苗)生产 体系 生产出来的。分原原种、原种、生产用种三个级别。2.2.1 原原种 p r e-e l i t e 用脱毒苗在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。2.2.2 原种e l i t e 用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。2.2.3 生产用种 c e r t i f i e d s e e d o r s e e d l in g 用原种作种薯，在隔离条件下生产出的 符合质量标准的种薯(苗)。2.3 病毒病株允许率 指各级甘薯种薯(苗)繁殖田中 病毒病株的允许比 率。3 检测对象 甘薯羽 状斑驳病毒(S w e e t p o t a t o f e a t h e r y m o t t l e v i r u s,S P F M V)=甘薯潜隐 病毒(S w e e t p o t a t o l a t e n t v i r u s,S P L V),4 抽样41 组培苗抽样4.1.1 脱毒核心材料:每株必须检测。4.1.2 扩繁苗:随机抽取 l 0 o-2%的扩繁苗检测。4.2 田间抽样4.2.1 原原种和原种抽样:定植后 3 0 天、6 0 天、收获前 2 周，在目测全田的基础上，采用五点取样法，中华人民共和国农业部2 0 0。一 0.0 9 一 2 2 批准2 0 0 0-1 2 一 0 1 实施 t N Y/T 4 0 2-2 0 0 0抽样数量为。.1 h m 以下2 0 0 株;o.1 1 一 1 h m 2 5 0 0 株;超出1 h m 面积，划出另一检验区，按本 规程规定的 面积取样。每株取上、中、下部叶片1-5 g，低温保湿存放，2 4 h内 检测。4.2.2 生产用种抽样:定 植后3 0 天、收获前两周，在目 测的基础上，采用随机取样法，0.1 h m 2 以下检验2 点，每点1 0 0 株;0.1 1 -1 h m，检 验 五点，每 点1 0 0 株;1.1 -5 h m，检验1 0 点，每点1 0 0 株;超出5 h m，面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。取样方法及样品保存同4.2.1,4.3 商品种薯(苗)抽 样 没有经过田 间检验的 种薯(苗)必须进行块根或种苗检验。4.3.1 根据甘薯种薯(苗)不同存放方式，采用分层设点取样或随机取样，抽样数量见表 1,表 1 抽样数量标准表种类种薯(苗)总量抽样百分率,%抽样最低数量薯苗c1 0 0 0 0 株6-1 01 0 0株1 0 0 0 0 株3.5种薯簇1 o o o o k g6-1 0l o o k g1 0 0 0 0 k g3-5注不足抽样最低数量的全部作为混合样品。2 将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取 1 0%的混合样品检测。5 检测方法5.1 X点酶联免疫吸附(D o t-E L I S A)检测法 用于检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒，检测方法见附录 A,5.2 指示植物检测法 用于辅助检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒，检测方法见附录 B,检测甘薯病毒的指示植物及症状见表 2,表 2 检测甘薯病毒的指示植物及症状 病 毒 种 类指 示 植 物S PFM VS PLV巴西牵牛巴 西 牵 牛症状羽 状 斑 驳叶脉变黄6 质t要求 凡斑点 酶联免疫吸附检测或指示植物 检测呈阳性者为带毒薯(苗)。原原种:病毒病株允许率是。原种:病毒病株允许率-2.。%。生产用种:病毒病株允许率(1 0 0 0 0N Y/T 4 0 2-2 0 0 0 附录A (标准的附录)斑点酶联免痊检测法A l 溶液配制 所用化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。Al.1 三经甲基氨基甲烷(T B S)(p H7.5)T r i s B a s e 4.8 4 g 氯化钠(N a C I)5 8.4 4 g 叠氮钠(N a N,)0.4 0 g 溶于1 9 9 0 m L蒸馏水中，用盐酸(3 7%)调p H至7.5，定容至2 0 0 0 m L,A 1.2 洗涤缓冲液(TT B S)1.0 mL吐温一 2 0(T we e n-2 0)溶于 2 0 0 0 mL TB S中。Al.3 抽提缓冲液 亚硫酸钠(N a z S O O 0.2 0 g 溶于T B S中.定容至1 0 0 m L,A 1.4 封闭缓冲液(现用现配)脱脂奶粉0.5 0 g 粹通 X-1 0 0(T r i t o n X-1 0 0)0.5 m L TB S 2 5 m L 先将脱脂奶粉溶 解于少量T B S 中，再用T B S 定容至2 5 m L。加 人T r i t o n X-1 0 0 混合均匀。A l.5 抗体稀释缓冲液 脱脂奶粉1.0 0 g TB S 5 0 m L 先将脱脂奶粉溶 解于少量T B S中，再用T B S 定容至5 0 m L.Al.6 底物缓冲液(p H9.5)T r is B a s e 6.0 5 g 氯化钠(N a C I)2.9 2 g 氯化镁(M 9 C 1 2 6 H 2 0)0.5 1 g 叠氮钠(N a N,)0.0 5 g 溶于4 5 0 m L蒸馏水中，用浓盐酸调p H值至9.5，定容至5 0 0 m L,Al-7 硝基蓝四哇盐(NB T)和 5-P A-4-X-3-9 9 1*磷酸醋(B C I P)储备液 N B T储备液:NBT 0.0 4 g 7 0%N,N一 二甲基甲酞胺1.2 m L 混合均匀，4 C避光保存。B C I P储备液:B CI P 0.0 2 g 7 0%N,N 一 二甲基甲酞胺l.2 m L 混合均匀，4 C避光保存。A1.8 底物溶液(现用现配)底物缓冲液2 5 mL N Y/T 4 0 2-2 0 0 0 N B T储备液7 5 p L B C I P储备液7 5 K L 先将 N B T储备液溶于 2 5 mL底物缓冲液中，再逐滴加入 B C I P储备液，边加边振摇混匀。A 2 样品制备 将待测叶片用清水清洗千净，从每一样品叶片上各取一直径约1 c m圆片，放人样品袋中，加入3 m L 抽提缓冲液充分研磨.4 静置 3 0 -4 0 mi n，取澄清汁液点样。样品为块根时催芽处理后取幼芽、叶制样。A 3 操作步骤A 3.，点样:将打好方格的硝化纤维素膜用T B S 缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取1 7 f t L 上清液滴在膜上方格的正中，干 燥 1 5 3 0 m i n。同时设阳 性、阴性和空白 对照，可根据需要设置重复。A 3.2 封闭:将干 燥后的膜浸泡在封闭 缓冲液中，室温下 摇床振荡(5 0 r/m in)1 h,A 3.3 孵育第一抗体:将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡(5 0 r/m i n)过夜。A 3.4 洗涤:用洗涤缓冲液洗膜 3 次，每次摇床振荡(1 0 0 r/mi n)3 m i n.A 3.5 孵育第二抗体:将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡(5 0 r/mi n)1 h,A 3.6 洗涤:洗涤4 次，方法同A 3.4.A 3.7 显色:将膜置于N B T/B C I P 底物溶液中，室温下摇床振荡(5 0 r/m i n)孵育3 0 m i n.A 3.8 终止反应:弃去底物溶液并用燕馏水洗膜3 次，每次摇床振荡(1 0 0 r/m i n)3 m i n.A 3.9 阳性判断:晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。N Y/T 4 0 2-2 0 0 0 附录B (标准的附录)指示植物检测法B 1 录育指 示植物 在防虫条件下盆栽巴西牵牛，至 1-2片真叶时嫁接。B 2 嫁接 以待测样品的 茎蔓为接穗，巴 西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部(子叶以下)斜切。将待检样品茎蔓切成 3 -5 段，每段带有至少一个腋芽，去叶后将底端削成楔型，插入砧木的切口内，用封 口膜扎紧，置2 6-3 2 防虫网室内遮荫保湿 2-3 夭。每个样品重复 3-5 次。同时设阳性对照、阴性对照。嫁接 1 0 -1 5 天后观察记载症状。B 3 阳性判断 根据指示植物症状，确定病毒有无及种类。在所有嫁接的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。