SNT 1454-2004 鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 4 5 4-2 0 0 4鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n f o r Ma r e k s d i s e a s e v i r u s o f c h i c k e n2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和国分众国家 质 量 监督 检 验 检 疫 总 局 ”S N/T 1 4 5 4-2 0 0 4前言本标准的附录A、附录 B均为规范性附录。本标准由国 家认证认可监督管理委员会提出 并归口。本标准由中 华人民 共和国 陕西出 人境检验检疫局和山 东出 人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:陈茂盛、管思平、马玉玲、寇改霞。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 4 5 4-2 0 0 4鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法范围本标准规定了鸡马立克氏病病毒(MD V)的分离鉴定方法。本标准适用于鸡马立克氏病(MD)流行病学调查和口岸检疫.2 材料准备2.12.22.32.42.52.62.72.8一日龄MD敏感鸡:用 S P F种蛋孵化。鸭胚成纤维细胞(D E F)的制备:见附录 Ae鸡胚成纤维细胞(C E F)的制备:同2.2.细胞培养液的 制备;见附录B,淋巴细胞分层液。标准的MD V分型单克隆抗体。缓冲溶液配制:磷酸盐缓冲液(P B S);含 0.0 5 纬吐温-2 0 的 P B S,以上溶液配制方法见附录 B,标准 MD V,MD V 工型病毒 G A毒株。3采样 挑选临床发病的M D疑似病鸡，无菌采集构棣酸钠抗凝全血5 m L/鸡1 0 m L/鸡，加人淋巴细 胞分层液,2 0 0 g离心 5 mi n，分离收集淋巴细胞，并用无菌 P B S洗涤两次，用细胞维持液稀释成 1 0，个/mL淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加人 1 5%的二甲基亚矾后保存在液氮(-1 9 6 0C)中备用。4操作方 法41 接种和培养 取生长良好的D E F单层，弃去维持液，接种。.2 m L处理好的淋巴细胞悬浮液，置含5%二氧化碳的培养箱，3 7 下吸附1.5 h。补充适量维持液继续培养，2 4 h内换液一次，以后每2 d-3 d 换液一次。在培养过程中每日观察细胞病变(C P E)产生情况，同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。4.2 收 集 在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下，将产生广泛 C P E(蚀斑形成面积占3 0 写以上)的D E F单层培养瓶中的维持液弃去，用。.0 l%胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用，或者加二甲基亚矾后置液氮(-1 9 6 0 C)中保存备用。4.3 克隆 将收集的具有广泛 C P E的细胞悬浮液进行稀释，接种于 9 6 孔细胞培养板，使每孔平均含有 1 个细胞，继续培养至孔内产生 C P E。选择只有单个病灶的孔，吹打下孔壁细胞，移人细胞培养瓶扩大培养。同法重复克隆二至三次。所收集的培养物就是供鉴定用的 MD V分离物。tS N/T 1 4 5 4-2 0 0 45 鉴 定5.1 电镜观察 将M D V分离物按照常规方法制成超薄切片，磷乌酸负染，用电子显微镜观察病毒的形态和大小。5.2 蚀斑测定 用 MD V分离物接种C E F次代单层，培养至 7 2 h，用测微器测量蚀斑大小，每份分离物至少测量 1 0个蚀斑，取其平均值作为蚀斑大小的测定值。5.3 单克隆抗体间接荧光染色试验 将出现 C P E的病毒分离物接种到放置盖玻片的细胞管，置二氧化碳培养箱中培养观察。当出现明显的病 毒蚀斑时，取出 管内盖 玻片，以冷的甲 醇(-2 0 0C)在4 条件下固 定1 5 m i n，然后用P B S 冲洗三次(每次5 m i n)，再滴加MD V分型单克隆抗体，放人3 7 的水浴中 作用9 0 m i n-1 2 0 m i n，用P B S 冲洗三次(每次5 min),滴加抗鼠免疫荧光抗体，在 3 7 水浴中作用 3 0 m i n，用含0.0 5%吐温-2 0的P B S冲洗三次(每次5 mi n)，然后用荧光显微镜检查细胞内荧光出现情况。5.4 容力鉴定 用 2 0 0。个蚀斑形成单位(P F U)的 MD V分离物和 2 0 0 0 个 P F U的G A标准强毒株分别接种一日龄易感鸡 2 0只一2 5只，同时设立相同数日的易感鸡对照组。分别隔离饲养 1 0 周，观察记录死亡情况，并剖检死亡鸡。隔离饲养期满，实验鸡全部剖杀作肉眼病理检查.6 结果判定6.1 MD V在电子显微镜下表现为近似圆形或者六角形的病毒颗粒或者核衣壳，多数出现在感染的细胞核中，偶见于细胞浆中，大小为8 5 q m-1 0 0 n m,6.2 MD V病毒可以在 D E F或者 C E F单层上产生蚀斑，蚀斑大小一般在 1 mm之内。血清 I型产生的蚀斑较小，血清11型产生大合胞体的中等蚀斑，血清)II 型产生大的蚀斑。6.3 经特异单克隆抗体间接荧光染色，在荧光显微镜下感染细胞将呈现清晰闪亮的黄绿色荧光。根据出现荧 光的 感染细胞所使用的 单克 隆抗体，可以 确定M D V分离毒株为 相应的 血清型。6.4 同 时符合6.1,6.2,6.3 三个试验结果的M D V分离物即 可以 判定为M D V，并确定其血清型。S N/T 1 4 5 4-2 0 0 4 附录A (规范性附录)鸭胚(鸡胚)成纤维细胞的制备A.1 将 S P F鸭种蛋孵化至1 2 d-1 4 d(S P F种鸡蛋孵化至9 d-1 0 d),A.2 用碘配和7 5%乙醇消毒外壳，打开气室，用灭菌镊子取出胚体，置于灭菌平皿，除去头、趾和内脏。将躯干用预冷的 H a n k s 平衡盐溶液冲洗三次，剪碎.A.3 用预 冷的H a n k s 平衡盐溶液尽可能地洗净组织碎块中 的血液，再用胰蛋白酶 溶液冲洗 一次，然后加人2 0 mL-5 0 m L的胰蛋白酶溶液，经磁力搅拌均匀，置3 7 水浴中消化 1 5 mi n,A.4 通过双层消毒纱布过滤细胞悬浮液，将滤液收集于灭菌离心管，以 1 0 0 0 r/mi n 离心 1 0 mi n，弃去上清液，加人预冷的 Ha n k，平衡盐溶液用同样的离心方法洗涤两次。A.5 弃去上清液，每 1 m L细胞沉淀加人细胞生长液 9 m L制成 1 0%的悬浮液，再用细胞生长液做1:4 0 稀释，分装于细胞培养瓶中，3 7 0C培养 4 8 h 即可作鸭胚(鸡胚)成纤维细胞使用。S N/T 1 4 5 4-2 0 0 4 附录B(规范性附录)试剂 的制备B.1 细胞培养液的制备B.1.1 H a n k s 平衡盐溶液的配制 A液 抓化钠(N a C 1)8 0.0 g 抓化钾(K C D 4.0 g 硫酸镁(Mg S O,7 H z O)1.0 g 抓化镁(M g C 12 6 H,O)1.0 g 双蒸水8 0 0.0 mL B液 抓化钙(C a C l 2)1.4 g 葡萄搪1 0.0 g 双蒸水2 0 0.0 m LB.1.2 按照上列顺序分别称量A,B液各试剂，溶解于双蒸水。B.1.3 将 A液和B液分别于。0 6 9 MP a-0.0 7 5 MP a 压力下高压灭菌 1 0 m i n或过滤除菌。B.1.4 冷却后，将B 液缓慢加人到A液，持续搅拌使之混匀。B.1.5 分装于工 0 0 mL-5 0 0 mL灭菌瓶中，密封瓶口，贮存于 4 或者室温下。B.2细胞生长液的配制B.2.1 顺序无菌称量以下试剂:5%水解乳蛋白溶液1 0.0 mL H a n k s 平衡盐溶液9.5 m L 犊牛血清S.0 m L 青霉素1.0 m L 链霉素0.5 m L 碳酸 氢钠 N a H C O,(7.5%)1.0 m LB.2.2 将上述试剂溶人 7 2.5 mL双蒸水中，并用双蒸水调节总量至 1 0 0 mL，充分混匀。B.3细胞维持液的配制方法同细胞生长液的配制，只需将犊牛血清含量调整为 1 mL-2 m L即可。B.4 磷酸盐缓冲液(P B S)的配 制B.4.1 所需试剂的准备 A液 氯化钠(Na C D 氯化钾(KC 1)氯化钙(C a C l 2 2 H,0)氯化镁(Mg C 1 2 2 H 2 0)8.0 g0.2 g0.1 3 2 g0.1 gS N/T 1 4 5 4-2 0 0 4 双蒸水8 0 0.0 mL B液 磷酸氢二钠(N a t HP O O 1.1 5 g 磷酸二氢 钾(K H z P 0 4)0.2 g 双蒸水2 0 0 mLB.4.2 依次分 别称量各试剂，溶 解于双燕水。B.4.3 以0.1 0 4 MP a-0.1 1 2 MP a 高压灭菌 A液,B液。B.4.4 冷却后，将B液缓慢加人到A液中，搅拌均匀并调节至p H7.0,B.4.5 分装于5 0 0 m L-1 0 0 0 mL灭菌瓶中，经无菌检验后贮存于4 下备用。B.5 含0.0 5%吐温-2 0 的磷酸盐缓冲液的配制B.5.1 按照 P B S 配制方法，去掉其中的抓化钙(C a C l i 依次溶人双蒸水，充分溶解，制成无钙镁 P B S,B.5.2 量取 0.5 mL吐温-2 0，加人到 1 0 0 0 mL无钙镁的 P BS,2 H2 0)和氯化镁(Mg c l z.2 H 2 0)，其余试剂P B S中，充分溶解即成为含 0.0 5%吐温-2 0