SNT 1421-2004 猪水疱病病毒微量血清中和试验.pdf

rI中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 4 2 1-2 0 0 4猪水疙病病毒微量血清中和试验M i c r o-s e r u m n e u t r a l i z a t i o n t e s t f o r s wi n e v e s i c u l a r d i s e a s e v i r u s2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局S N/T 1 4 21-2 0 0 4.J.曰.o l1青本标准的附录A是规范性附录，附录 B是资料性附录.本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:杨素、潘文波、廖秀云、冯家望。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 4 2 1-2 0 0 4猪水疙病病毒微t血清中和试验范围本标准规定了猪水疙病病毒微量血清中和试验方法。本标准适用于猪水疙病病毒中和抗体的检测。2缩略语下列缩略语适用 于本标准2.1C P E:致细胞病变作用。T C I D,o:半数细胞感染量。S V D:猪水疤病。原理 特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。本标准规定的中和试验是以定量病毒稀释血清为基础，当血清能阻止定量病毒 5 0%致细胞病变能力时，其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定猪水疙病血清抗体的方法。试荆和材料4,1 本标准所用试剂配制见附录A,4.2 本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。4.3 本标准所用试剂、玻璃器皿除有特殊规定外，均需高压灭菌。4.4 病毒:用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的猪水疙病病毒作为标准病毒。4.5 标准血清:标准阴性血清采用无 S V D病毒抗体的猪血清，标准强阳性和弱阳性血清采用 S V D病毒感染发病后康复的猪血清。4.6 细胞系:I B-R s-2 传代细胞系.4.7 细胞培养液:含 1 0%胎牛血清(经 5 6 0C,3 0 mi n 灭能)及抗生素的细胞培养液。4.8 细胞维持液:含2 纬胎牛血清(经 5 6-C,3 0 mi n灭能)及抗生素的细胞维持液。4.9 细胞分散液。4.1 0固定液。4.1 1 染色液。5 器械和设备5.1 二氧化碳培养箱、微量振荡器、倒置显微镜、冰箱、超声波细胞破碎仪.5.2 1 0 0 m L细胞培养瓶、9 6 孔微量细胞培养板、吸头、多道可调移液器、单道可调移液器.S N/T 1 4 21-2 0 0 46 预备试验6.1 将 S V D病毒接种 I B-R s-2 细胞单层，3 7 吸附 I h后加人维持液，置 5%二氧化碳培养箱于 3 7 C培养，接种2 4 h后用倒置显微镜逐日观察，待C P E达 7 5%以上，冻融一次或置冰浴中用超声波处理(4 0 p A,l m in),2 0 0 0 r/m in 离心2 0 m i n，上清 液分装小瓶，每瓶1 m L，置一7 0 保存备用。6.2 病毒毒价的测定及其工作浓度的配制:将病毒原液用细胞维持液做 1 0倍系列稀释至 I,)-，每个稀释度作8 个孔，每孔 5 0 p L，每孔加5 0 p L工作细胞液，再补充细胞维持液5 0 p L。每块板设 4 孔正常细胞对照，于 5 写二氧化碳培养箱 3 7 C 培养，从 4 8 h 开始至 9 6 h 用倒置显微镜逐日观察记录 C P E，按K a r b e r 方法计算 T C I D;o。将病毒原液配制成 1 0 0 T C I D;o/5 0 p L，备用。6.3 将标准阳性血清、阴性血清、被检血清经5 6 0C 3 0 min灭能，备用。6.4 将细胞用细胞培养液稀释成工作细胞液(1 0 个细胞/mL)，备用。7中和试验7.1 对照设立7.1.1 细胞对照:设4 孔正常细胞对照，每孔加工作细胞液5 0 p L、细胞维持液 1 0 0 p L,7.1.2 强阳性血清对照:将已知滴度的标准强阳性血清用细胞维持液在 9 6孔微量培养板上从 1:4 开始做 倍比 系列稀释，每 个稀释 度作5 个孔(5 0 p L/孔),4 孔加1 0 0 T C I D;o/5 0 p L 病毒 悬液5 0 p L，微量振荡器振荡混匀，置 5%二氧化碳培养箱 3 7 中和 Ih，再加人工作细胞液 5 0 k L/孔。余下的一孔作为7.1.6 所描述的血清毒性对照，7.1.3 弱阳性血清对照:将已知滴度的标准弱阳性血清用细胞维持液在 9 6孔微量培养板上从 1，4 开始做倍比系列稀释，每个稀释度作 5 个孔(5 0 p L/孔),4孔加1 0 0 T C I D;a/5 0 K L病毒悬液5 0 p L，微量振荡器振荡混匀，置 5%二氧化碳培养箱 3 7 中和1h，再加人工作细胞液5 0 P L/孔。余下的一孔作为7.1.6 所描述的血清毒性对照。7.1.4 阴性血清对照:设 5 孔阴性血清对照 4 孔加阴性血清和 1 0 0 T C I D 5 o/5 01 L病毒悬液各5 0 p L,再加人工作细胞液 5 0 p L o余下的一孔作为7.1.6 所描述的血清毒性对照。7.1.5 病毒 回归对照:将病毒稀释为 1 0 0 0 T C I D s o/5 0 I.L,1 0 0 T C I D;o/5 0 y L,1 0 T C I D s o/5 0 t L,1 T C I D s o/5 0 p L，每个稀释度作 4 孔，每孔加人病毒悬液5 0 K L，再加人工作细胞液 5 0 K L，每孔补充细胞维持 液5 0#,L,7.1.6 血清毒性对照:被检血清每个稀释度设 1 孔血清毒性对照，即 5 0 I L各稀释度血清，补充 5 0 p L维持液，再加人工作细胞液5 0 t L a7.2 被检血清中和试验7.2.1 被检血清用细胞维持液在微量培养板上从 1，4 开始做倍比系列稀释，每个稀释度作 5 孔，每孔5 0 p L,7.2.2 被检血清每个稀释度 4 孔加人预备试验滴定好工作浓度的病毒悬液 1 0 0 T C I D s o/5 0 p L，微量振荡器振荡混匀，置5%二氧化碳培养箱 3 7 中和 Ih，再加人工作细胞液 5 0 u L，余下的一孔作为7.1.6所描述 的血 清毒性对照。7.2.3 将 9 6孔微量细胞培养板置于含 5%二氧化碳的培养箱中，3 7 C培养2 d-4 d.7.3结果判定7.3.1 用倒置显微镜观察，4 8 h 初判，9 6 h终判，终判前需固定染色。7.3.2 终判定前的固定染色:弃去培养液，每孔加 5 0 p L固定液，固定 3 0 mi n，弃去固定液，将板浸人染色液中3 0 m i n。流水冲洗，观察结果。7.3.3 结果判定需以各对照成立为前提，当病毒回归为 1 0 s TC I D,o -1 0=s T C I D;o，标准强阳性血清、标准弱阳性血清效价与原滴定效价相差 1 个滴度以内，标准阴性血清对照孔未着色.细胞对照孔细胞染 zS N/T 1 4 21-2 0 0 4成蓝色时，才能进行终判。7.3.4 被检样品孔细胞层染成蓝色判为阳性，细胞层染成空白判为阴性(细胞出现 C P E，经固定染色后为 空白;细 胞未出现C P E，经固定染色后，细胞层染成蓝色)。血清效价以5 0 终点血清与病毒混合液中血清的总稀释度表示。7.3.5 O I E/F A O参考实验室判定标准参见附录 B,S N/T 1 4 2 1-2 0 0 4 附录A(规范性附录)试剂配制A.1 细胞培养液的配制 1 9 9 培养基(或 ME M 等其他培养基)，加人 1 0%胎牛血清(5 6 C 3 0 m i n灭能)，含青霉素2 0 0 I U/m L,链霉素2 0 0 f a g/m L，抽滤除菌分装，4 保存备用.A.2 细胞维持液的配制 1 9 9 培养基(或 ME M 等其他培养基)，加人 2%胎 牛血清(5 6 0C 3 0 min灭能)，含青霉素2 0 0 I U/m L，链霉素 2 0 0 f a g/m L，抽滤除菌分装，4 保存备用。A.3 抗生素选用及工作浓度参考表(每毫升培养液含f)两性霉素 B制霉菌素庆大霉素卡那霉素新霉素青霉素 G链霉素多猫菌素 B1.2 5 W g1 0 0 I U5 0 f a g5 0拜 g5 0 M g1 0 0 I U -2 0 0 I U1 0 0 fa g-2 0 0 fa g1 0 0 I UA.4 细胞分散液的配制胰酶乙二胺四乙酸二钠(E D T A)无钙镁 P B S抽滤除菌，冻存。2.5 g0.2 g1 00 0 m 1A.5无钙镁 P B S的配制 氯化钠8.0 g 氯化钾029 磷酸氢二钠1.1 5 g 磷酸二氢钾。.2 9 三蒸水1 0 0 0 mL 将上述成分依次溶解，分装、高压灭菌或抽滤备用。A.6 固定液的配制 1 0%福尔马林。A.7 染色液的配制 亚甲蓝0.5 g 固定液1 0 0 0 mL 4S N/T 1 4 2 1-2 0 0 4 附录B (资料性附录)O I E/F A O今考实脸室判定标准 由于实验室之间对终点的确定会有不同，或不同操作人员之间对病毒定量和血清稀释以及使用的试 剂不同，因而常会 造成试 验结果的 差异，所6:!各 实验室可 通过O I E/F A O世界F M U参考实脸室提供的标准试剂做参考来建立 自己的标准.O I E/F A O参考实验室判定标准为:在 5 0%终点，血清与病毒混合液中血清的总稀释度为 1:4 5 或1，4 5以上为阳性;1，1 6 至 1，3 2 为可疑,1:1 1 或小于1:1 1 为阴性。