SNT 1174-2003 猴D型逆转录病抗体检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 7 4-2 0 0 3猴 D型逆转录病抗体检测方法A n t i b o d y d e t e c t i o n m e t h o d s f o r s i m i a n r e t r o v i r u s t y p e D2 0 0 3-0 3-1 7 发布2 0 0 3-0 9-0 1 实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 肩S N/T 1 1 7 4-2 0 0 3.山 J.J.o li台本标准的附录A为规范性附录。本 标准由国 家认证认可 监督管理委员会提出 并归口。本标准由中华人民共和国云南出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:贾建军、周晓黎、徐自忠、应雪松。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 7 4-2 0 0 3猴 D型逆转录病抗体检测方法范围本标准规定了猴D型逆转录病毒病抗体检测方法和结果判定。本标准适用于猴D型逆转录病毒病的检疫。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日 期的引用文件，其随后所有的修改 单(不包括勘误的内 容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法(e q v I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。3.1 CP E 致细胞病变作用。3.2 T CI D9 o 半数组织培养感染量。3.3 EL I S A 酶联免疫吸附试验。3.4 W e s t e rn b l o t 蛋白印迹试验。3.5 S O S-P AGE S I D S聚丙烯酞胺凝胶电泳。4原理4.1 E LI S A原理 E L I S A方法的 基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变 抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出 现颜色 反应。因 此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色 反应的 深浅与标本中 相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过 E L I S A检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使 E L I S A方法成为一种既特异又敏感的检测方法。S N/T 1 1 7 4-2 0 0 34.2 We s t e rn B l o t 原理 先将被 检的 抗原或抗体蛋白 经电 泳分离并转移至一种固相支持体上，用制备好的针对抗原蛋白 的特异性抗体或提纯的 抗原作为探针检测已固 定好的 抗原蛋白 或抗体蛋白.这 个探针用特定的 放射或酶显色系统进行标记，通过抗原抗体反应并有显色 反应来判断被检物是否的特异的抗体或抗原物质。5 试剂和材料5.1 水:本标准所用水应符合G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 中二级水的 规格。5.2 病毒:猴艾滋病D型逆转录病毒(s i m ia n r e t r o v i r u s t y p e D,S R V)，由指定单位提供。5.3 血清:猴艾滋病D型逆转录病毒阳 性血清、阴性血清由 指定单位提 供。5.4 被检血清。5.5 细胞:R a j i，由指定单位提供。5.6 培养液:1 6 4 0 培养基中 加人1 0%的胎牛血清(经5 6 C 3 0 m i n 灭活)含青 霉素2 0 0 I U/m L,链霉素2 0 0 la g/m L,5.7 维持液和稀释液:维持液为1 6 4 0 培养基中加人2%的胎牛血清(经5 6 V 3 0 m i n 灭活)含青霉素2 0 0 I U/mL、链霉素 2 0 0 p g/mL,稀释液为维持液不加 2%的胎牛血清。5.8 羊抗猴 I g GS P A酶(辣根过氧化物酶)、包被液(p H9.6)、封闭液、终止液、底物液、血清稀释缓冲液等。按附录A配制。器械和设备倒置光学显微镜。普通光学显微镜。二氧化碳培养箱。冰箱(一2 0 保存血清、一7 0 保存种毒)。4。孔或9 6 孔聚苯乙烯。酶标仪。电泳仪和垂直电泳槽。蛋白转移电泳仪和转移电泳槽。硝酸纤维素膜(NC膜)、分析用滤纸、海绵.单头和多头微量移液器及滴头(2 0 tt L-2 0 0 P L),66.1626.36.46.56.66.768697.1 操作方法7.1.1 抗原制备:S R V感染R a j i 细胞，1 0 0 0 0 病变收获培养液反复冻融二至三次，3 0 0 0 r/m i n 离心1 5 m i n，沉淀细胞碎片，上清液装于透析袋，用聚乙二醇(P E G分子量2 0 0 0 0)脱水浓缩五倍。用2 0%-6 0%蔗糖梯度离心纯化抗原(2.0 m g/m L)，稀释成1，2 0 0 或 更高.7.1.2 抗原滴定:将浓缩的 抗原用p H 9.6 的 包被液按不同稀释度稀释包被板，按7,2 试验程序操作，每稀释度加1，2 0 的阳 性血清和阴性血清，进行试验，在4 1 4 m m波长处测定O D值，以 显示P/N值为2.1-2.5 的抗原最高稀释度，作为抗原的滴度，每 批抗原滴定一次。7.1.3 抗猴I g G辣根过氧化物酶结合 物的 滴定:在包被有抗原的 板上滴加1，2。的阳性血清和阴 性血清各一排，然后加不同稀释的 酶结合物。以 最高稀释度的酶结合物显示尸/N值为2.1-2.5 者为结合物的滴度。7.2 试 验程序7.2.1 用 p H 9.6 的包被液稀释抗原，加在酶标板上，每孔 5 0 y L,4 过夜。S N/T 1 1 7 4-2 0 0 37.2.2 试验时，取出板，将孔内抗原溶液甩掉，用 P B S T洗三次。甩干，备用。7.2.3 用稀释缓冲液将待检血清作 1，1 0 0稀释，每孔 5 0可，每份血清加两孔，同时每块板加 1:1 0 C稀释的阳性血清或阴性血清各两孔作对照。置湿盒中，3 7 0 C 1 h,7.2.4 用P B S T洗板三次，每孔加5 0 K L 用P B S T 作1:1 5 0 0 稀释的 酶结合物。置湿盒中，3 7 0C 1 h,7.2.5 用柠檬酸缓冲液将底物母液A B T S 作1，1 0 0 稀释，每孔加1 0 0 t x L,3 7 C 1 0 m i n-3 0 m in 待阳性血清充分显色后，每孔加 1 0 0 p L 2 m o l/L硫酸终止反应。7.3 结果判定 在4 1 4 mm波长处测定O D值。阳性、阴性和待测血清计算出2孔的平均值。判定标准:待测血清的O D值(P)与阴性血清的O D值(N)之比(P/N值)小于2.1 为“一”待测血清的 O D值(P)与阴性血清的O D值(N)之比(P/N值)大于等于 2.1 为“+”。We s te rn Blo t 操作程序1 S D S凝胶电泳1.1 准备电泳的玻璃夹层，根据生产厂家的说明安装玻璃板，并放在水平位置。1.2 尽快从电泳玻璃夹层间灌人至离梳子下 1.5 c m处，注意要均匀，胶成一直线。胶表面有气泡，coas.氏立即用带有一尼龙管注射器把气泡吸出，然后轻轻加人少量 d H2 0于胶表面，要均匀，保持胶表面成一直线，胶做好后，置于室温 2 2 0 C -2 5 至少 4 5 mi n 以上。8.1.3 灌上层胶(浓缩胶)前，把下层胶表面水吸出，再加人 d H 2 0洗一次。8.1.4 准备上层胶(浓缩胶)，配制见附录 A，配好后立即加在下层胶(分离胶)上面，慢慢加人避免有气泡，加至能充满梳子，如有气泡，如上法吸出，放人梳子，完毕，用锡纸或胶纸封上，避免水分蒸发，可第二天使用。8.1.5 等 上层胶(浓缩胶)凝固后，取出 梳子用无离子 水冲洗加样梳孔，将凝胶放人电 泳槽上。上下槽均加人电泳缓冲液，检查是否泄漏，驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡，并用电泳缓冲液冲洗梳孔。8.1.6 准备加样，第一，二行为低标准分子量和高标准分子量蛋白(可预先准备分装冻存备用)，其他各行根据试验需要准备.8.1.7 对各抗原测定蛋白浓度，计算好样品量，标明，按量放人一小试管内，加人等量的 2 X标本缓冲液，充 分用吸管混匀，使病毒破碎，轻轻盖上胶塞，放人沸水内 煮沸9 0 s，加人澳酚蓝液5 p L-1 0 I L,8.1.8 按原计算量用吸管轻轻加人加样孔内，未使用的孔要用电泳缓冲液填满。8.1.9 电流。开始时电压为8 V J c m凝胶，待染料进人分离胶后，将电压增加到 1 5 V f c m凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，关闭电源，取下凝胶。8.2 蛋白转移和抗原抗体试验8.2.1 蛋白转移8.2.1.1 剪六块滤纸和一块硝酸纤维素膜，其大小应与 S D S-凝胶的大小相同，将剪好的滤纸及纤维素膜在转移缓冲液中浸泡3 m i n-5 m i n,8.2.1.2 将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。8.2.1.3 把经电泳完毕的玻璃夹层取下，放于内有擦手纸的盘内，轻轻掀起面层玻璃(如胶粘着上层玻璃下不来，则用吸管吸溶液把胶冲下)。量胶长，并作记录。8.2.1.4 将三块滤纸对齐放在海绵上，依次放置纤维素膜、凝胶。另外三块滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。最后用塑料支架夹紧上述各层，放人电转移槽内，注意 纤维素膜一侧靠 正极，胶一侧靠负极，接通电源电压4 0 V，电流。.1 7 A-0.2 A，转移1.5 h -6 h,8.2.1.5 转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔在膜的上缘作好标记，切下其中一个孔所对应膜的二分之一，用氨基黑染色 3 0 s,1 0%乙酸脱色，检查转移是否完全;也可将转移后的凝胶作考S N/T 1 1 7 4-2 0 0 3马 斯亮蓝染色来检 查转移效果 将其余含抗原的部分放人盛有封闭液(A.1 8)的盘内，震荡 1 h，如用封闭液放 4 可延长至 1 d -3 d.8.2.1.6 封闭完毕，用水或洗液(A.2 0 a)洗 膜，(如用明胶封闭液，可把盘 放热水上溶化明胶)，按抗原部 位把膜割成小条(做好上下端记号)，即时进行试验，或用滤纸包裹，放于含。.0 2 0 0 叠氮钠P B S 中，里4 待用.8.2.2 抗原抗体试验8.2.2.1 把 抗原小条放孵 育盘槽内，记录各槽应加人的血清种类，包括有阳 性、阴性对照血清和待测血清。8.2.2.2 各血清 用稀释液(A.1 9 a)稀释成I，1 0 0 -1，2 0 0,视槽大 小以盖过 小条为宜，然后放震荡器上2h 至过夜。8.2.2.3 去血清液 用水 洗一次或用洗液(A.2 0 a)洗三次每次5 m i n,8.2.2.4 加人用稀释液(A.1 9 6)稀释的 羊抗猴I g G酶结合物(1，5 0 0 稀释)，震 动 1 h-2 h,8.2.2.5 去酶结 合物 溶液，用水洗一次，复用转移缓冲液震动1 h 再用水洗一次 或用洗液(A.2 0 b)洗三次每次 5 m i n,8.2.2.6 加人底物液(A.2 1)5 mi n-1 0 mi n显色，去溶液，用水洗一次，干燥，记录结果并保存。8.2.2.7 结果判定:逆转录D型病毒有意义的带有三条即G P 7 0,P 2 7 和P 2 0。待测血清与P 2 7 有反应即可判阳性.如只与外的一条或两带有反应为可疑，三条带全无反应为阴性。S N/T 1 1 7 4-2 0 0 3 附录A (规 范性附录)溶液配方A.1 包被液(p H 9.6)碳酸钠(N a t C O,)碳酸氢钠(N a H C O,)0.7 9 g(含 1 0 H,0 2.1 3 g)1.5 g加水至5 0 0 mL，用 1 m o l/L氢氧化钠调至 p H 9.6 使用