SNT 1166.1-2002 水泡性口炎补体结合试验操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 6 6.1-2 0 0 2水泡性口炎补体结合试验操作规程P r o t o c o l o f c o mp l e me n t f i x a t i o n t e s t f o r v e s i c u l a r s t o ma t i t i s2 00 2 一 11 一 25发布20 0 3 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 6 6.1-2 0 0 2H IJ舀 水泡性口炎(Ve s i c u l a r S t o ma t i t i s,V S)补体结合试验在参考国际兽疫局(OI E)(哺乳动物、禽和蜜蜂 A和 B类疾病诊断试验和疫苗标准手册 和实践经验的基础上制定。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:花群义、周晓黎、徐自忠。本标准系首次发布的检验检疫行业标准S N/T 1 1 6 6.1-2 0 0 2水泡性口炎补体结合试验操作规程范围本标准规定了水泡性口炎补体结合试验方法。本标准适用于动物水泡性口炎病毒抗原检测。2规范性引用文件 下列文件中的条款通过在标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方 研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法(e q v I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)缩略语3.3.33.334 下列缩略语适用于本标准。1 C F:补体结合试验。2 C H;-5 0%补体溶血单位。3 V S V:水泡性口炎病毒。4 V S V-N J:水泡性口炎病毒新泽西型;V S V-I ND水泡性口炎病毒印地安那型。5 VB D:巴比妥缓冲液。6 P B S:磷酸盐缓冲液。原理 补体结合试验包括两个系统，第一系统为反应系统，即已知抗原(或抗体)，被检血清(或抗原)和补体。第二系统为指示系统(亦称溶血系统)，即溶血素加绵羊红细胞，溶血素即抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只能与抗原一 抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此，如果试验系统中的抗原和抗体是对应的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加人指示系统，由于缺乏游离补体，就不产生溶血，即为阳性反应。反之试验系统中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素加绵羊红细胞免疫复合物激活，发生溶血，即阴性反应。5试剂和材料5.1 溶血素:由指定单位提供。也可用5 0%的绵羊红细胞连续免疫家兔而获得兔抗绵羊红细胞血清，即溶血素。5.2 补体:由指定单位提供。也可采集健康的公豚鼠血清,2只3只豚鼠血清混合，分装成每小管1 mL，置于一2 5 以下低温冻结保存使用。5.3 2.8%绵羊红细胞悬液的制备:可直接购买保存于阿氏液中 的绵羊红细胞。也可自 行采血，保存于阿氏液中。用前用冷 V B D离心洗涤三次至上清液清亮。若三次离心仍不能使上清液清亮，则应更换新批号的红细胞。取离心沉淀的绵羊红细胞(按离心管上的刻度定即可)2.8 MI，加 9 7.2 m L的 V B D,S N/T 1 1 6 6.1-2 0 0 2摇匀即成。5.4 病毒;V S V-N J 和 V S V-I N D国际标准毒株，由指定单位提供。5.5 标准阳性对照抗原和标准阴性抗原的制备:见附录 A.5.6 标准阳性血清:VS V-N J 和 V S V-I ND血清效价应达到 1:1 6以上。由指定单位提供。5.7 标准阴性血清:VS V-N J 和 V S V-I N D标准阳性血清互为阴性血清对照。由指定单位提供。5.8 VB D稀释液:见 附录 A,5.9 磷酸盐缓冲液(P B S):见附录 A,5.1 0 水:符合 G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2分析实验室二级水规格。6器械 和设备 分析天平、离心机、分光分度计、试剂瓶、高压灭菌器、干烤箱、超声波粉碎机、显微镜、微型振荡器、水浴锅、二氧化碳培养箱、冰箱(一2 5 保存血清一 7 0 保存种毒)。9 6 孔“U，形底孔板，可调单孔道、多 孔道微量移液器及滴头(2 0 F L-2 0 0 川 一)。刻度玻璃吸管等。水泡性 口炎补体 结合试验7.1 试验准备7.1.1 被检样品的处理:补体结合试验一般的检测对象是疑似感染 V S V的细胞培养物、水泡皮、水泡液及喉头刮取液等，后三种样品要制成2 0%的悬液用于检测。水泡液可以直接使用，或用 P B S做尽可能少量的稀释。水泡皮加玻璃砂研磨，用P B S制成 1:1 0和 1:3 0的悬液(1:3 0 作为补充试验之用，因为 1，1 0 悬液有时会出现抗补体现象)，以5 0 0 0 r/mi n(1 0 0 0 X g)离心 5 mi n 备用。若样品含毒量不高，比如样品不新鲜，则需通过细胞分离培养病毒，用于C F试验。7.1.2 V S V-N J和VS V-I N D标准阳性血清做 1:1 6 稀释。7.1.3 1:1 6 稀释的 V S V-N J和VS V-I N D灭能阳性血清可互为阴性血清对照。7.1.4 溶血素的 滴定7.1.4.1 溶血素滴定的方法按表 1 进行:取三块“U 型板，每块板除补体的稀释度不同外其余均相同。第一块板用 l:2 0 0稀释的补体，第二块板用 1:3 0 0 稀释的补体，第三块板用 1:4 0 0稀释的补体。每块板使用六排，每排都按表 1 加样。7.1.4.2六组不同的致敏红细胞的制备:先将溶血素做1:1 0 0 0,1:2 0 0 0,1:2 5 0 0,1:3 0 0 0,1:4 0 0 0,1:8 0 0。共六个稀释度，分别各取 1 ml与 1 ml的 2.8%绵羊红细胞混合，于室温作用 1 5m i n 即为致敏红细胞。7.1.4.3 将三块板的每一排按表 1 加好后，置 3 7 作用 3 0 m i n，离心后判定。以最低稀释度的补体而产生最高溶血的溶血素稀释度即为一个溶血素单位。若补体已经滴定完成，那么溶血素的滴定应使用三个 5 0%溶血单位的补体(3 C H;o)再滴定一次溶血素，以确证溶血素的使用滴度。表 1 溶血素的滴定单位为毫升横 排 孔 号1234O6V B D0.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 5补 体0.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 5六组不同的致 敏 红 细 胞0.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 27.1.5 补体的滴定7.1.5.1 溶血系统(致敏红细胞)的制备取三个溶血素单位，对半加人 2.8%绵羊红细胞，摇匀后于室温下作用 1 5 min即成 2S N/T 1 1 6 6.1-2 0 0 27.1.5.2 5 0%溶血单位补体(C H s,)的滴定 补体 稀释 按表2 进行。表 2李 卜 体稀释单 位 为 毫 升试管序号1234567891 01 11 21 1 0 补休1.01.01.00.50.50.50.50.50.2 50.2 50.2 50.2 5VBD补 体9.01 41 91 21 4.51 71 9.52 21 2.2 51 3.51 4.751 6稀 释度1 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 5 04 0 04 5 05 0 05 5 06 0 06 5 0 上述每个稀释度加人“U 型板的四个孔，每孔。.0 5 mL。每孔再分别加。.0 5 mL VB D。对照四孔，每孔加 V B D 0.1 0 mL.不加补体。封板后于 3 7 0C保温 1 5 m i n，在所有孔分别加溶血系统 0.0 2 5 mI，摇匀后于 3 7 保温 3 0 mi n,1 5 mi n时摇一次。以5 0 0 0 r/mi n(1 0 0 0 X g)离心5 m i n,根据溶血判断结果。若1:3 5 0 稀释的补体发生 5 0%溶血，则认为。.0 5 mL 该稀释度的补体为 1 个CH-。若用 3 个 C H 5 ，相当于3:3 5 0 稀释，即1:1 1 6.6。取 0.0 5 mL I:1 1 6.6 稀释的补体即为 3 C H;o。若1 e 2 0 0 稀释度溶血7 5%,l，2 5 0 稀释度溶血2 5%.那么 5 0 溶血的终点为1，2 2 5,3 C H 即。.0 5 mL 1，7 5 稀释的补体。7.2试验程序7.2.1 C F试验程序 用VB D将 V S V抗血清做 1，1 6稀释，并干 5 6 水浴灭活 3 0 mi n-6 0 m i n(以完全灭活补体活性为 原则)。每 一种抗血清在.U 型板上做四横排相同的试验，以 其中的一横排为例。第一孔加2 5 川l 1 6 的抗血清，其余孔分别加2 5 刃 的V B D。在第二孔中加5 0 川 1 1 6 的抗血清，并用5 0 川 微量稀释器从第二孔开始向后稀释，每孔剩余 2 5 u L.从第 1 孔到第 1 2孔的稀释度分别为I e 1 6,1 e 2 4,1:3 6,1:5 4,1:8 1,1:1 2 2,1:1 8 3,1:2 7 5,1:4 1 2,1:6 1 8,1:9 2 1,1:1 3 9 1。每孔分别为加5 0 ,L补体(3 C H;o)和2 5 川 待检抗原，摇匀后置3 7 C 感作6 0 m in。每孔加2 5 川 的 溶血系统。封板并充分摇匀，于3 7 C 作用 3 0 m i n,1 5 m i n摇一次。以5 0 0 0 r/mi n(1 O O O Xg)离心 1 0 m i n后判定 5 0 溶血终点。实验步骤见表 3.C F试验必须设立对照试验，见表 4,以上作为病毒的定性试验，若要进行病毒定量，可根据表 3 的试验结果确定血清的稀释度，然后固定血清稀释病毒。试验方法同表 3 07.2.2 每次试验应按表 3 的微量 C F试验程序，设立阳性对照板。表 3 CF试验程序(以其中的一排 为例)单位为微升S N/T 1 1 6 6.1-2 0 0 2表4 C F对照试验表单 位 为 微 升7.2.3 溶血标准比色管的制备7.2.3.1 溶血液的配制吸取 1.0 m1.2.8%的红细胞悬液置于一个大试管中，加人 7.0 m L水，摇动试管直至红细胞完全溶解。再加人 2.0 ml,VB D充分混匀。7.2.3.2 0.2 8%红细胞悬液的制备:取1.0 m工2.8%的红细胞悬液加 9.0 m L的V B D混匀。7.2.3.3 不同百分比溶血标准颜色管的制备:按表 5 进行，将 1-1 1 管分别加人“U”型滴定板的一排，每孔0.1 2 5 ml。封板后以5 0 0 0 r/m i n(1 O O O Xg)离心5 mi n，每一排孔沉淀红细胞的大小和溶血程度(测定 O D,.)代表着一个标准。比如第六排(来源于 6号试管)为5 0 溶血的标准，测定其 O D-，这个值即为 5 0%溶血的标准值。表 5溶血标准色管的制备X1 tr*44+试 管 号34567891 01 1 溶 血 液 0.2 8%红细胞溶液血百分比(%)01.0 00.10.91 00.20.82 00.30.73 00.40.64 00.50.55 00.60.46 00.70.37 00.80.28 00.s0.19 01.0 01 0 07.2.4结果判定 在对照试验成立的前提下按如下原则判定:7.2.4.1 若某一排孔 1 0 0%不溶血，或该排第一孔 1 0 0%不溶血(或溶血不超过 5 0%),随着血清的稀释，后面各孔的溶血程度逐渐增加，而其余各排孔均为 1 0 0%溶血(或第一孔溶血超过