SNT 1151.1-2002 对虾Taura综合征病毒(TSV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 5 1.1 一 20 0 2 对虾 T a u r a 综合征病毒(T s v)逆转录聚合酶链式反应(R T-P C R)诊断方法T e s t m e t h o d o f r e v e r s e t r a n s c r i p t io n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t io n(R T-P C R)f o r t u a r a s y n d r o me v i r u s(T S V)2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 0 3 一 0 5 一 01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 51.1-2 0 0 2目q台本标准的附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:江育林、高隆英、刘鱿、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 51.1-2 0 0 2 对虾T a u r a 综合征病毒(T S V)逆转录聚合酶链式反应(R T-P C R)诊断方法范 围 本标准规定了用聚合酶链式反应技术检测对虾T a u r a 综合征病毒的方法。本标准适用于对虾T a u r a 综合征病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件 其随后所有的修改单(不包括 勘误的内 容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根 据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2分析实验室用水规格和试验方法(e q v I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)33.13.23.33.43.53.6试 剂和材料 水应符合 G B/T 6 6 8 Z-1 9 9 2中一级水的规格。Ta q酶-2 0 保存 不要反复冻融或温度剧烈变化。逆转录酶A MV-2 0 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。R N A抑制剂又 R N a s i n)一 2 0 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。d N T P 含d C T P,d G T P,d A T P,d T T P 各 1 0 mm o l/L)引物浓度为4 0 p m o l/I。其序列如下:上游引物 T S VF:S-T C A A T G AG A G C T T G G T C C-3 下游引物 TS VR:5 一 AAG丁AG ACA GC C GCG CT丁一 3 异丙醇分析纯，使用前预冷到一2 0 C,矿物油要求无 D N A酶和 R NA酶。剪刀、镊子器材和设备 P C R扩增仪 电泳 仪 微量移液器及吸头 紫外观察灯 恒温培养箱 普通冰箱和低温冰箱，尹口UO户工JQ以qJ月马4.14.24.34.44.54.6S N/T 1 1 5 1.1-2 0 0 24.7 电动匀浆器4.8 离心机和离心管5 T a u r a综合征病毒核酸的鉴定5 1 采样 取活虾，或取头部放在9 5%的 酒精中(可以在常温下保存3 0 d)，但样品 处理前须让酒精完全挥发。取约 5 0 mg-1 0 0 mg的鳃丝(或者附肢、上皮、血淋巴)，放在 1.5 m L的离心管中。5.2 样品处理 应在1 0 以 下进行 先加人1 5 0 p L C T A B(见附录A.1)溶液，用小剪刀剪碎后，用电 搅拌器将样品匀浆成糊状。再加 C T A B溶液到 9 0 0 p L,混匀后于 2 5 作用 2h5.3 R N A抽提 在含有样品的离心管中加人6 0 0 p L 抽提液1(见附录A.2)，充分混匀 3 0 s,1 2 0 0 0 r/m in 离心5 m i n，取一层水相(约7 5 0 p L)。再加人6 5 0 p L 抽提液2(见附录A.3)，充分混匀3 0 s,1 2 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n，取上 层水 相(约6 0 0 p L)。再加人1.5 倍体 积的异丙醇(约9 0 0 川一)，倒置数次 混匀后，-2 0 C,8 h 以上以 沉淀核酸，1 2 0 0 0 r/m i n 离心3 0 s，弃去上清，干燥后加 1 0 p L无菌蒸馏水溶解，用作P C R模板。5.4 变性和退火 在P C R管中加人1 0 p L 模板和5 p L 引物(上游引物和下 游引物各2.5 p L)，置于7 0 反 应5 m i n,立即冰浴，低速离心约 5s 使液体集中在底部。5.5 c D N A合成 在上述反应管中继续加人d N T P 2 P L,5 倍逆转录酶缓冲液(见附录 A.6)5 I L,R N A抑制剂(2 0 U)0.5 p L、无菌蒸馏水1.5 p L，再覆盖5 0 p L 矿物油。将P C R管置于P C R 扩增仪中，3 7 C 反应1 0 m i n 后，再加人1 p L逆转录酶A M V(2 0 U)并低速 离心。4 2 C 6 0 mi n 反应以扩增出模板的 c D N A。反应结束后，7 0 C 1 0 mi。灭活逆转录酶，立即冰浴。5.6 P C R扩增 D N A 在上述反应管中再继续加人T a q 酶S U,d N T P 1 p L，反向引物和正向引物各1 p L,2 5 m m o l/L的氯化镁(M g c l,)(见附录A.7)1 0 p L,1 0 倍 T a q 酶浓缩缓冲液(见附录A,8)1 0 p L、加水到总体积1 0 0 p L,混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于 P C R扩增仪。先 9 4 C 4 m i n-5 0 C 1 mi n-7 2 C 1 min，再9 4 C 1 m i n-5 0-C 1 m i n-7 Z C 1 mi n,3 5次循环，然后7 Z C 5 mi n，最后4 C保温。57 设立对照5.7.1 在6.1 中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。5.7.2 取含有已知 T a u r a 病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。5.7.3 取正常的细胞悬液作为阴性对照。5,7.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。5.8 琼脂糖电泳 用T B E(见附录A.4)电泳缓冲 液配制2%的琼脂糖(含。.5 p L/m L E B.见附录A.5)平板。将平板放人水平电 泳槽，使电泳 缓冲液刚好淹没 胶面。将6 p L 样品和2 I L 样品缓冲液(见附录A.9)混匀后加入样品孔 在电泳时设 立 D N A标准分子量Ma r k e:作对照，推荐使用p U C 1 9 D N A/M s p l(H p a l l).5 V/c m电泳约。5 h,当澳酚蓝到达底部时停止。6.16.26.36.4结果判 定 在紫外灯下观察核酸带并判断结果。P C R后阳性对照会出现一条 2 1 3如 的DN A片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带 待测样品电泳后在相应 2 1 3 b y D N A位置上有带者为阳性。无带或带的大小不是2 1 3 b y的为阴性。S N/T 1 1 5 1.1-2 0 0 2 附录A (资料性附录)试荆配制A.1 CT AB溶液 按2 0 o C T A B,1.4 m o l/L 抓化钠(N a C D,2 0 m m o l/L E D T A,2 0 m m o l/l.T r i s-H C I p H 7.5 配制。用前加。.2 5 疏基乙醇。A.2 抽提液 1 酚/三氯甲烷/异戊醇:用 1 mo l/L T r i s 水溶液饱和的酚，三氯甲烷，异戊醇=2 5;2 4 1 混合，密闭避光保存。A.3 抽提液 2 三氯甲烷/异戊醇:将二者按 2 4 1的比例混合，密闭避光保存。A.4 T B E电泳缓冲液 5 倍浓缩液)T r i s 5 4.0 g 硼酸2 7.5 g E DTA 2.9 g 加水到1 0 0 0 mL 用5 mo l/L的盐酸(HC D 调到p H8.0,A.5 E B(核酸染色剂)用水配制成1 0 m g/m 工 的浓缩液。用时每1 0 m l 电泳液或琼脂中加1 川。A.6 逆转录酶的 5 倍浓缩缓冲液Tr i s-H C I氯化钾(K C D氯 化镁(M g c l,)DTT2 5 0 m mo l/L p H 8.33 7 5 mmo l/L1 5 mmo l/L5 0 mmo l/LA.7 氮化镁(Mg C 1 2)2 5 m mo l/LA.8 T a q酶用 1 0 倍浓缩缓冲液T r i s-HCI氯化钾(K C DT r i t o n X-1 0 05 0 0 m mo l/L p H 8.85 0 0 mmo l/L1%A 9样品缓冲液每 1 0 0 m 工溶液中含:澳酚蓝 0.2 5 g，蔗糖 4 0 g,