SNT 1146-2002 植物检疫 烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 4 6-2 0 0 2 植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法 P l a n t q u a r a n t i n e-Me t h o d f o r i n s p e c t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n o f t o b a c c o r i n g s p o t N e p o v i r u s2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 0 3 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 4 6-2 0 0 2前言本标准附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:陈枝楠、郑文华、邓琼、王东勇。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 4 6-2 0 0 2 植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法范 围本标准规定了进境植物检疫中对烟草环斑病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物种子、苗木、繁殖材料和植物产品中烟草环斑病毒 的检疫鉴定。2原理 烟草环斑病毒(T o b a c c o r i n g s p o t N e p o v i r u s，简称 T R S V)为等轴多面体球状病毒，直径为2 5 n m2 9 n m，属线虫传多面体病毒属成员。可侵染 5 4 科、2 4 6 种植物，其中主要的经济作物有:豆类、马铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜瓜、胡萝 卜、唐营蒲、百合、莺尾、李属、苹果、葡萄、甜樱桃等。该病毒主要分布于北美、大洋洲、欧洲、非洲等国家，具有寄主广泛，危害症状明显、免疫原性强、容易制备高滴度、专业性强的病毒抗血清等特点。通过血清学双抗体夹心法(D A S-E L I S A)和鉴别寄主生物学鉴定方法或免疫电镜检测，可以作为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据。3仪器3.1研钵3.2 微量榨汁机3.3 酶标仪3.4 低速离心机(转速为4 0 0 0 r/mi n)3.5 生物培养箱(具有光照，温度可调范围为。C-5 0,C)3.6 酶联板(4 8 孔或 9 6 孔)3.7 E p p e n d o r f 管(体积为 1.5 mL)3.8 微量移液器(分为1 0 0 p L,2 0 0 p L,l 0 0 0 1,L 单头，1 0 0 p L 或2 0 0 t L 8 孔道一支及相应吸头)3.9 恒温水浴锅或恒温培养箱3.1 0 分析电子天平3.1 1 p H计3.1 2白瓷盘(4 0 c m X 5 0 c m)及钝头镊子3.1 3 隔离检疫温、网室试剂4.1 1 0 x P B S T缓冲液 将氯化钠(N a C I)8 0 g,磷酸二氢钾(K H,P O,)2 g,磷酸氢二钠(N a,H P O,)1 1.5 g,氯化钾(K C l)2 g、吐温2 0(T w e e n-2 0)5 m I 溶解于1 0 0 0 m l 蒸 馏水中 形成的 液体4.2样品提取缓冲液 将亚硫酸钠(N a,S O,)1.3 g,聚乙烯基毗咯烷酮(MW2 4-4 0 0 0,P V P)2 0 g,叠氮钠(N a N,)0.2 g,吐温 2 0(T we e n-2 0)2 0 m l.溶解于 1 0 0 0 ml.P B S T中，用浓盐酸(H C l)调节 p H值至 7.4，并储存于 4。S N/T 1 1 4 6-2 0 0 24.3 包被缓冲液 将碳酸钠(Na _ C O,)1.5 9 g,碳酸氢钠(Na HC O,)2.9 3 g,叠氮钠(Na N,)0.2 g 溶解于1 0 0 0 mL蒸馏水中，用浓盐酸(HC I)调节 p H值至 9.6，并储存于4 C,4.4 洗涤缓冲液 将 1 X P B S T缓冲液用浓盐酸(HC ll调节 p H值至 7.4，并储存于 4 C,4.5酶标结合物缓冲液 将 1 X P B S T缓冲液 8 0 0 ml、小牛血清白蛋白(B S A)2 g,P V P(MW2 4-4 0 0 0)2 0 g,叠氮钠(N a N,)0.2 g 用蒸馏水定容至1 0 0 0 m l，并储存于 4 C,4.6 P N P P底物缓冲液 将二乙醇胺 9 7 mL,叠氮钠(N a N O0.2 g 溶解于 1 0 0 0 mL蒸馏水中，用浓盐酸(HC D调节p H值至9.8，并储存于 4 0C.4.7 PN PP底物溶液 将 4-硝基酚磷酸钠盐(p-n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e，英文简称为 P NP P)1 0 0 mg溶解于 P N P P缓冲液1 0 0 ml中，现用现配制。4.8终止反应液 将氢氧化钠(N a OH)4 0 g溶解于 1 0 0 0 m L蒸馏水中。4.9种子表面消毒液 将 3 0%次氯酸钠 1 0 0 mr溶解干9 0 0 m 工蒸馏水中制成浓度为3%的消毒液。4.1 0生物试剂 可采用烟草环斑病毒检测试剂盒或生物检测试剂。包括烟草环斑病毒抗体(I g G),碱性磷酸酶标记的烟草环斑病毒酶标抗体(I g GE n z y me-C o n j u g a t e d),阳性对照和阴性对照。4.1 1 2%醋酸铀染液 将 2g 醋酸铀溶解于 9 8 mL蒸馏水中，定容至 1 0 0 mL，现配现用。注:本 标 准 未 作 特殊 说 明，所 使 用 试 剂 均 为 分 析 纯5现场检疫与抽样5.1抽查 按货物批量总件数的 5%-2 0%随机抽查，最低抽查件数 1 0件，不够最低检查数量件数的全部检查。52抽样 按照附录A的规定随机抽取植物种子、苗木、鳞球茎或其繁殖材料样品。5.3检测样品 每批货物送检检测样品种子应不少于 1 0 0 0 粒，鳞球茎应不少于2 0 个(头)，苗木或其繁殖材料应不少于 1 0 株(枝)。若少于 1 0 株(枝)时应全部送检。6检疫鉴定6.1 双抗体夹心法(D A S-E L I S A)6.1.1 样品制备6.1.1.1 种子类 随机抽取 1 0 0 粒种子经 3%次氯酸钠表面消毒 1 0 mi n 后，用无菌水洗涤三次，将种子置于铺有吸水纸的白瓷盘中，分五组将种子分列其中，在适宜的发芽温度(2 0 C-2 8 C)条件下催芽，直至长出第一对真叶(发芽时间大约一周).随机抽取2 0株苗叶片，每株叶片约 1 g(3片/株一4 片/株)，用微量榨汁机(或每克组织加人 4 m 工样品缓冲液研磨)榨出汁液分别盛装于 E p e n d o r f 管中，加人二分之一至三分之S N/T 1 1 4 6-2 0 0 2一 E p e n d o r f 管体积样品提取缓冲液(如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行)制备成一个样品。6.1.1.2鳞球(块)茎类 将至少2 0 个(头)鳞球茎或块茎芽眼(处于休眠状态的还要打破休眠)在生物培养箱(2 0 C-2 8 C)中催芽，直至长出叶片。随机抽取 1g叶片(3片/株4片/株)，鳞球茎也可直接用解剖刀切取 2 g-4 g 组织，用微量榨汁机(或每克组织加人 4 m L样品缓冲液研磨)榨出汁液分别盛装于 E p e n d o r f 管中，加人二分之一至三分之一E p e n d o r f 管体积样品提取缓冲液(如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行)制备成一个样品口6.1.1.3种苗类 取 1 g(3片/株4 片/株)表现症状植株叶片和无症状表现叶片，用微量榨汁机(或每克组织加入4 mL 样品缓冲液研磨)榨出汁液分别盛装于 E p e n d o r f 管中，加人二分之一至三分之一 E p e n d o r f 管体积样品提取缓冲液(如选用商品检测试剂盒则按照试剂盒要求进行)制备成一个样品。6.1.2操作步骤6.1.2-1 根据检测需要设计9 6 孔(或4 8 孔)酶联板点样孔。包括2个阳性对照孔、2 个阴性对照孔、2 个4个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。6.1.2.2 每 孔加 人2 0 0 1,1 抗T R S V I g G溶液.3 7 C 孵育2 h-4 h(或4 冰箱 过夜)。6.1.2.3空干后用 1 X P B S T洗涤液洗涤酶联板 3 次或 3 次以上。每次3 mi n e6.1.2.4 每 孔加人2 0 0 川 待检测样品 液,3 7 C 孵育2 h-3 h(或4 冰箱 过夜).6.1.2.5 洗涤与 6.1.2.3的要求相同。6.1.2.6 每孔加人2 0 0 川 酶标抗体溶液，3 7 C 孵育2 h-4 h(或4 冰 箱过夜)。6.1.2,7 洗涤与6.1.2.3的要求相同。6.1.2.8 每孔加入2 0 0 I L P N P P 底物溶液.室温孵育0.5 h -2 h,6.1.2.9 必要时每孔加人5 0 H L 1 m o l/I 氢氧化钠溶液终止反应(若立即检 测O.D.值则不 需要)。6.1.2-1 0用肉眼观察判断酶标板颜色反应结果或者用酶标仪分别在。5 h,1 h和2h 检测 A 4 0 5 n m的 O.D.吸收值6.1.3 若采用商品化烟草环斑病毒检测试剂盒则可按照试剂盒检测指导说明进行操作6.2鉴别寄主生物学检测方法 对经D AS-E L I S A检测出阳性的样品，采其适量叶片，加人适量样品提取缓冲液研磨后用摩擦接种法接种栽种于室温(2 0 C-2 5 C0)检疫隔离温、网室中的昆诺要、黄瓜、白肋烟、长虹豆和菜豆 P i n t o 等鉴别寄主植物 昆诺落(C h e n o p o d i u m q u i n o u)接种叶出 现坏死斑或局部褪绿斑;黄瓜(C u c u m i s s a t i v u s):接种 5 d-7 d后，接种叶局部褪绿斑，后出现系统环斑,1 0 d 后植株扭 曲变形;白 肋烟(N i c o t i a n a t a b a c u n c v.Wh i t e B u r l e y)接种后4 d-7 d，接种叶出 现局部褪绿斑或坏死 斑，约 1 5 d 后发展为系统褪绿或坏死斑，后期或温度超过 3 0 C时新长叶无症带毒;长;:豆(V i g n a s e s q u i p d s a l i s)接种 4 d -7 d，接种叶出现褐色的坏死斑或环斑，约 1 0 d-1 5 d 生长点坏死，最后全株枯死;P i n t o 菜豆(P h a s e o l u.s v u l g a r i s c v.P i n t o):接种5d-7 d 后，接种叶出现局部坏死环斑,1 0 d 工 5d 后系统环斑.生长点坏死。6.3免疫 电镜6.3.1 取经 D A S-E L I S A检测后样品呈阳性反应的植株叶片，用微量榨汁机制备样品提取汁液.经离心取上清液。6.3.2 将铜网(F o r mv a r 膜)光滑面浸在一滴适量稀释浓度(2 0。倍1 0 0 0倍)的抗病毒血清 匕 室温下(2 0 C一2 5 C)孵育 o.5 h oS N/T 1 1 4 6-2 0 0 26.3.3 用滴管滴 1 0 滴 1 X P E S T洗液于铜网，洗涤0.5 h,6.3.4 将包被了抗病毒血清的铜网浮在样品提取液上.在室温孵育 1 h-4 h 后，洗涤同6.3.3.6.3.5 将洗涤后的铜网浮在新配制的 2%醋酸铀上 1 0 m i n，经吸水纸完全吸去染色液干燥后，进行扫描电镜观察。结果判定7.1 血清学检测结果判定 当待检样品孔和阳性样品孔有颜色反应，阴性对照孔无颜色反应，且其 O.D 值小于。.0 5，且重复检测样品O.D.值平行允许率(P)小于2 0%时则 判定检测结果有效。取孵育1 h 后检测的O.D.值，计算带测样品O.D.值和阴性对照O.D 值之比值(P I N).若 P I N大于 2,双抗体夹心法(D A S-E L I S A