SCT 7217-2014 刺激隐核虫病诊断规程.pdf

SC/T7217-20145.2普通光学显微镜。5.3盖玻片、载玻片、培养皿。5.4研磨棒（与1.5mLEP管配套）。5.5台式离心机。5.6水浴锅。5.7普通冰箱。5.8微量移液器。5.9PCR扩增仪。5.10水平电泳系统。5.11凝胶成像仪或紫外检测仪。6刺激隐核虫病简介参见附录B。7采样按SC/T7103的规定执行。8诊断方法8.1临床症状检查8.1.1外观检查鱼的体表（参见图C.1)和鳃（参见图C.2)上呈现许多小白点（俗称“白点病”），鳃丝苍白，黏液增多，体表出血、溃疡和糜烂。8.1.2行为观察病鱼摄食量减少，身体消瘦，游动缓慢，呈分散状态、离群漫游。时常翻转身体，呼吸频率加快，严重时导致死亡。8.2显微镜检查用载玻片将鱼体表的黏液轻轻刮下压片，显微镜下可见黏液中有黑色圆形或椭圆形虫体（参见图C.3),大小为0.2mm0.5mm。取鳃丝压片，显微镜下也可见鳃丝上皮浅层中具有黑色圆形或椭圆形虫体（参见图C.4),虫体周身被纤毛，活体可持续旋转运动。8.3PCR检测8.3.1虫体DNA的提取取1个或几个虫体，置于干净平皿中，用灭菌水反复洗涤3次，再转移到洁净的离心管中。用研磨棒磨碎，使其充分破裂。然后，加入蛋白酶K(终浓度为200g/mL)消化，按微量样品基因组DNA抽提试剂盒说明书的方法提取DNA。将提取的DNA用TE溶液或双蒸水稀释至总体积40L,4保存待用。8.3.2PCR扩增8.3.2.1PCR扩增对照样品PCR扩增反应中设立阳性对照样品、阴性对照样品和空白对照样品。以虫体DNA作为阳性对照样品，取健康鱼肌肉组织抽提DNA作为阴性对照样品，取等体积的水代替模板作为空白对照样品。8.3.2.2第一轮PCR扩增采用50L反应体系，向0.2mLPCR管中依次加入10PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、引物1和引2