乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法 杯碟法.doc

乳及乳制品中舒巴坦敏感-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法范围本标准规定了乳及乳制品中舒巴坦敏感-内酰胺酶类药物的检验方法杯碟法。本标准适用于乳及乳制品中舒巴坦敏感-内酰胺酶类物质的检验本标注的方法检出限：4U/mL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(neqISO3696:1987)3原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有-内酰胺酶类药物。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水，4.1试验菌种藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001,传代次数不得超过14次4.2标准物质4.2.1青霉素对照品。4.2.2-内酰胺酶标准品。4.2.3舒巴坦对照品。4.3工作溶液的配制4.3.1磷酸盐缓冲溶液：pH6.0.称取8.0g无水磷酸二氢钾，2.0g无水磷酸氢二钾，溶解于水中并定容至1000mL.4.3.2生理盐水：8.5g/L,称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中，121高压灭菌15min。4.4标准溶液的配制21.4.1需素标准溶液：准确称取适量（精确至0.1mg)青霉标准物质(4.2.1），用磷酸盐缓冲溶液(4.3.1)溶解并定容为0.1mg/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。1.4.2-内酰胺酶标准溶液：准确量取或称取适量-内酰胺酶标准物质(4.2.2)，用磷酸盐缓冲溶液(4.3.1)溶解并定容为16000U/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。如果购买的-内酰腔不是标准物质，则应按照附录B方法进行标定后，再配制成16000U/mL的标准溶液。4.4.3舒巴坦标准溶液：准确称取适量（精确至0.1mg)舒巴坦标准物质(4.2.3），用磷酸盐缓冲溶液(4.3.1)溶解并定容为1mg/mL的标准溶液，分装后-20保存备用，不可反复冻融使川4.5培荞基4.5.1营养琼脂培养基：见第A.1章，4.5.2抗生素检测用培养基：见第A.2章。4.6总液的制备将试验菌种(4.1)接种于营养琼脂斜面(4.5.1)上，经(361)C培养18h-24h,用生理盐水(4.3.2)洗下菌苔即为菌悬液,测定菌悬液浓度,终浓度应大于110FU/mL,4保存。贮存期限2周。5主要仪器5.1抑菌圈测量仪。5.2生化培养箱：(361)。.3高压灭菌器5.4培养皿：内径90mm,底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。5.5牛津杯:不锈钢小管,外径(8.00.1)m,内径(6.00.1)mm,高度(10.00.1)mm。5.6氏比浊仪或标准比浊管。5.7pH计6测定步骤6.1样品的制备将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为：A、B、C、D,每个样品做三个平行，共12管，同时每次检验应取纯水1mL加入到1.5mL离心管中作为对照。如样品为乳粉，则将乳粉按1：10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，应调节pH值至6-7,6.2检验用平板的制备取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基I(4.5.2)凝固后-3-上层加入5mL含有浓度为110CFU/mL的藤黄微球菌CMCC(B)28001抗生素检测用培养基(4.5.2)，凝固后备用。6.3样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准溶液(4.4.1)、-内酰胺酶标准溶液(4.4.2)、舒巴坦标准溶液(4.4.3)加入到样品(6.1)及纯水(6.1)中：A青霉素5LB舒巴坦25L、背霉素5LC-内酰胺酶25L、青霉素G5L。D-内酰胺酶25L、舒巴坦25L、青素5L。并将上述AD试样各200L加入放置于6.2上的4个8mm钢管中，(36土1)培养培养1822h,测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。结果报告纯水样品结果应为：(A)、(B)、(D)均应产生抑菌圈：(A)的抑菌图与(B)的抑菌圈相比，差异在3mm以内（含3mm),且重复性良好；(C)的抑菌圈小于(D)的抑菌围，差异在3mm以上（含3mm),且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定，7.1如果样品结果中(B)和、(D)均产生抑菌圈，且(C)与(D)抑菌圈差异在3mm以上（含3mm)时，可按7.1.1、7.1.2判定结果7.1.1(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差异在3mm以上（含3mm),且重复性良好，应判定该试样添加有-内酰胺酶，报告-内酰胺酶类药物检验结果阳性。7.1.2(A)的抑菌图同(B)的抑菌圈差异小于3mm,且重复性良好，应判定该试样未添加有B-内酰胺酶，报告-内酰胺酶类药物检验结果阴性。7.2如果(A)和(B)均不产生抑菌围，应将样品稀释后再进行检测4附录A(规范性附录)培养基A营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15-20 g蒸馏水1000 mL制作：分装试管每管约5-8mL,120高压灭菌15min,灭菌后摆放斜面A.2抗生素检测培养基蛋白胨10g牛肉浸膏3g氯化钠5g酵母膏3g葡萄糖1g琼脂粉14g蒸馏水1000mL制作：120C高压灭菌15min,其最终pH值约为6.65附录B(规范性附录)青霉素酶活力标定方法1.溶液的配制：(1)青霉素溶液的制备称取青霉素钠（钾）标准品适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每mL中含1万单位的溶液。(2)青霉素酶稀释的制备取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释成1mL中约含青霉素酶8000-12000单位的溶液，在37下预热。(3)碘滴定液(0.005mol/L):精密量取碘(0.05mol/L)10mL,置100mL容量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度。(4)磷酸盐缓冲液(pH7.0):取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000mL(5)醋酸钠缓冲液(pH4.5):取冰醋酸13.86mL,加水使成250mL;另取醋酸钠27.30g加水200mL,两液混合均匀，2.标定步骤精密量取青霉素1万单位/mL溶液50mL,置100mL容量瓶中，预热至37后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25mL,迅速混匀，在37准确放置h,精密量取3mL,立即加至已精密量取的碘滴定液(0.005mol/L)25mL,在室温暗处放置15min,用硫代硫酸钠滴定液(0.01moi/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液。继续滴定至蓝色消失。空白试验，取已预热的青霉素溶液2mL,在37放置！h,精密加入上述碘滴定液25mL,然后精密加青霉素酶稀释液1mL,在室温暗处放置15min,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按照下式计算：E=(B-A)XMXFXDX100式中E为青霉素酶活力，单位(mLh)B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量(mL)A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量(mL)M为硫代硫酸钠滴定液的浓度(mol/L)F为在相同条件下，每1mL的上述滴定液(0.005mol/L)相当于青霉素的效价，单位。D为青霉素酶溶液的稀释倍数。6