DB21T 1697-2008 辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程.doc

DB××/T ××××—×××× 辽宁省质量技术监督局 发布 2009-01-01实施 2008-12-05发布 辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程 （Liaoning cashmere goat straw frozen semen manufacture regulations） DB21/T 1697—2008 DB21 辽宁省地方标准 ICS 备案号： 1 DB21/T 1697—2008 目 次 前 言 II 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 术语和定义 3 4 规格与质量标准 3 5 制作程序 3 6 解冻 4 7 检查 4 8 包装 4 9 保存和取用 4 10 容器清洗 4 11 细管冻精运输 4 II 前 言 本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归口。 本标准由辽宁省辽宁绒山羊育种中心、辽宁省畜牧科学研究院负责起草。 本标准的主要起草人：刘兴伟、韩迪、豆兴堂、王世权、刘庆权。 辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程 1　范围 本规程规定了辽宁绒山羊细管冷冻精液的技术要求、制作程序、解冻、检验、标记、包装、存放、取用、运输及容器清洗等方法。 本规程适用于辽宁绒山羊，其他品种绒山羊可参照本规程。 2　规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。 GB 5458 液氮生物容器 GB/T 1.1-1993标准化工作导则 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 精子密度：1ml精液中的精子数。 有效精子数：有效精子数=精液量×密度×活力。 精子活力：37℃环境下直线运动精子数占总精子数的百分率。 精子顶体完整率：顶体完整精子数占总精子数的百分率。 精子畸形率：畸形精子数占总精子数的百分率。 精子存活率：在37℃环境下保存4h时直线运动精子数占总精子数的百分率。 细菌数：一剂量冻精解冻后经培养所长出的菌落数。 4　规格与质量标准 4.1　规格 0.25ml剂型。 4.2　质量标准 4.2.1　精子活力≥30%。 4.2.2　每剂细管冻精有效精子数≥1500万个。 4.2.3　精子畸形率≤20%。 4.2.4　精子顶体完整率≥50%。 4.2.5　细菌数≤1000个。 4.2.6　解冻后的精子存活时间 在5℃～8℃条件下精子保持30%活力的时间≥12h；在37℃条件下精子保持30%活力的时间≥4.5h。 4.2.7　标识 在冻精细管上,打印品种、羊号、生产日期。 4.2.8　灌装后必须封口严密,在解冻时不能进水，同时在细管冻精的前端留约0.8cm的空隙。 5　制作程序 5.1　采精种公羊的标准 种公羊的体型外貌和生产性能均应符合一级以上种羊标准。种公羊必须体质健壮，无下列传染病：布鲁氏杆菌病、副结核病、口蹄疫、蓝舌病、及其它隐性遗传缺陷性疾病。 5.2　采精方法 应用假阴道法进行采精，采精前分别用温水和灭菌生理盐水清洗公羊阴茎和包皮。 5.3　原精质量标准 颜色为乳白色或淡黄色,精子密度≥15×107/ml,活力≥60%,畸形率≤10%。 5.4　精液的稀释 5.4.1　器具卫生 所用器具，保证清洁、无菌、无消毒剂残留。 5.4.2　稀释保护剂的配制 配制冻精用的稀释保护剂，必须用新鲜的双重蒸馏水、卵黄或在保质期内的无动物来源精子细胞膜保护剂，其它药品为分析纯化学试剂。如使用成品稀释液,则应选择国家认定的标准稀释液生产厂家生产的细管冻精稀释液。 5.5　降温和平衡 稀释后的精液，经1～1.5h逐渐降温到4℃～5℃，然后在此温度下平衡2～4h。 5.6　冷冻 将平衡后的细管精液移至－95℃±5℃的低温环境中,冷冻3min，然后浸入液氮中。 6　解冻 将液氮中的细管冻精取出,立即浸没于38℃～40℃的温水中,轻轻摆动约20s取出,用干净纱布擦干。 7　检查 每只种羊的细管冻精抽检1～2剂。保存的细管冻精,每6个月抽检一次,每次抽检3－5剂。 7.1　解冻活力检查 细管冻精解冻后，分别在细管上、中、下部分别取精液少许置于显微镜下观察3－5个视野，目测视野中呈直线运动的精子数占总精子数的比例，估测出平均活力。 7.2　有效精子数测定 在采集原精后,用分光光度仪、红细胞计数板或精子密度检测仪测出原精的精子密度,再根据稀释倍数,计算出稀释后的精子密度,再根据解冻后的细管冻精活力计算出每剂细管冻精的有效精子数。 7.3　顶体完整率和畸形率测定 用姬姆萨染色法或1000倍的带光栅的相差显微镜观测细管冻精的顶体完整率和畸形率，每个样品观察精子总数≥500个。 7.4　解冻后存活时间测定 取同一位置的细管冻精10只,同时浸入38℃～40℃的温水中，待解冻后同时置于37℃恒温水浴锅中，先测定第一剂细管冻精的活力,然后每隔0.5h,观测第二剂细管冻精的活力,依此类推,直到水中的细管冻精的精子全部死亡或活力降到30%为止,从而得到至精子全部死亡时的存活时间和解冻活力降至30%时的存活时间。 7.5　细菌数检查 取0.20ml解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37℃恒温箱中培养24h，统计出现的菌落数。 8　包装 0.25ml细管冻精采用指形管包装,每个指形管中装有合格细管冻精25剂,每8个指形管包装于一个布袋内。 9　保存和取用 9.1　保存 检查合格的细管冻精贮存于装有液氮的生物容器内,定期添加液氮,使细管冻精始终浸没于液氮中。在每个包装袋上注明种羊羊号、解冻后活力和数量。 9.2　取用 取细管冻精时,将冻精袋提升到液氮罐颈口下约10cm处,用长镊子迅速将细管冻精取出进行解冻,操作时间≤10s,需继续取出细管冻精,则将冻精包装袋浸入液氮中,再重复以上操作,取出的细管冻精停留在空气中的时间≤5s。 10　容器清洗 液氮生物容器，应在使用前后彻底检查和清洗。清理时，先用中性洗涤剂刷洗，再用40℃～45℃温水冲洗干净，在室温下放置48h以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器，应定期清洗。 11　细管冻精运输 必须使用合格的超低温生物运输容器进行运输。 2