DB33T 783-2010 脱毒芋艿种芋(苗)病毒检测技术规程.pdf

ICS 65.020.01 B15 浙江省地方标准DB33DB33/T 7832010脱毒芋艿种芋（苗）病毒检测技术规程 Rules for virus detection of virus-free seed(seedling)taros 2010-04-07 发布 2010-05-07 实施浙江省质量技术监督局 发布 DB33/T 7832010 I 前 言 本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。本标准由浙江省种植业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：浙江大学生物技术研究所、台州市农业科学研究院、金华市农业科学研究院、永康市农业技术推广中心。本标准主要起草人：毛碧增、陈银龙、张尚法、成其仓、胡明龙。DB33/T 7832010 1 脱毒芋艿种芋（苗）病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了脱毒芋艿（Colocasia esculent L.）种芋(苗)的术语和定义、检测对象、质量要求、检验方法和检验规则。本标准适用于脱毒芋艿种芋（苗）的病毒检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 NY/T 402-2000 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 脱毒核心种苗 通过植物组织培养技术获得的，经检测不带芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的种苗。3.2 扩繁脱毒苗 由脱毒核心种苗经组织培养繁殖获得的苗。3.3 脱毒种芋 由扩繁脱毒苗繁育，经种芋生产体系生产出来的，分脱毒原原种芋、脱毒原种芋和生产用脱毒种芋。3.4 脱毒原原种芋 扩繁脱毒苗在容器内生产的和在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种芋。3.5 脱毒原种芋 脱毒原原种芋在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种芋。3.6 生产用脱毒种芋 由脱毒原种芋在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种芋。3.7 脱毒率 不带指定病毒的种芋（苗）数占所检测种芋（苗）总数的百分比。DB33/T 7832010 2 4 检测对象 芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）。5 质量要求 脱毒核心种苗、扩繁脱毒苗和脱毒原原种芋脱毒率：100%。脱毒原种芋脱毒率：98%。生产用脱毒种芋脱毒率：95%。6 检验方法 6.1 电镜检测法 6.1.1 负染色法 用于检验芋花叶病毒（DsMV），检测方法按附录A执行。6.1.2 超薄切片法 用于检验芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV），检测方法按附录B执行。6.2 双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)采用芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）商品检测试剂盒，进行DAS-ELISA检测，检测方法按NY/T 401-2000中附录A的方法执行。7 检验规则 7.1 组批 同一时间，同一地点，取得同一品种不同单株的脱毒种芋（苗）为同一组批。7.2 抽样方案 7.2.1 脱毒核心种苗 每株必须检测。7.2.2 扩繁脱毒苗 随机抽取1%2%检测。7.2.3 脱毒原原种芋和脱毒原种芋 幼苗期、球茎膨大期和收获前两周，采用五点取样法。种植面积：0.1 hm2 取样200株；0.11 hm2 1 hm2 取样500株；1 hm2，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取叶片1 g5 g，4 冰箱保存，24 h 内检测。7.2.4 生产用脱毒种芋 球茎膨大期，采用随机取样法，抽样方法按NY/T 402-2000的4.2.2执行。7.3 判定规则 当检验批满足质量要求时，判该批产品合格，并附芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告（参见附录C）。DB33/T 7832010 1 附 录 A(规范性附录)负染色检测法 A.1 2%磷钨酸负染色液（PTA，pH 6.7）磷钨酸2 g用双蒸馏水定容至100 mL，1 mol/L的NaOH调pH至6.7。A.2 操作步骤 A.2.1 研磨 取新鲜叶片1 g5 g，加双蒸馏水充分研磨，获得组织汁液。A.2.2 蘸样 用铜网有膜的一面蘸取组织汁液，停留1 min2 min后用滤纸吸去多余汁液。A.2.3 负染色 铜网经2%磷钨酸负染色1 min后，吸去多余染色液，室温下晾干。A.2.4 电镜观察 铜网置于透射电镜下观察，芋花叶病毒（DsMV）为马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，病毒粒子线状、略弯曲，长约750 nm。DB33/T 7832010 2 附 录 B(规范性附录)超薄切片检测法 B.1 溶液配置 所有化学试剂为分析纯，双蒸馏水配置。B.1.1 2.5%戊二醛固定液 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）50 mL 25%戊二醛 10 mL 加双蒸馏水至 100 mL。B.1.2 1%四氧化锇固定液 2%四氧化锇水溶液：将 0.5 g 或 1 g 装四氧化锇的安瓿瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶中，在排毒柜内把安瓿瓶敲破，即刻加入双蒸馏水，配制成 2%水溶液，盖上盖子，溶解 1 d。1%四氧化锇固定液：0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）5 mL 2%四氧化锇水溶液 5 mL B.1.3 醋酸双氧铀染色液 醋酸双氧铀 2 g 50%乙醇 100 mL 充分摇动 10 min，静置 1 d2 d，使未溶解部分自然沉淀，取上清液使用。溶液呈鲜黄色，溶液宜用棕色瓶避光保存。B.1.4 柠檬酸铅染色液 硝酸铅 1.33 g 柠檬酸三钠 1.76 g 双蒸馏水 30 mL 将上述成分放在 50 mL 容量瓶中，用力振荡 30 min，使溶液呈乳白色，加入 1 mol/L NaOH 8 mL，溶液变透明，再加双蒸馏水定容 50 mL。B.2 操作步骤 B.2.1 取样 叶片切成1 mm22 mm2小块。B.2.2 固定 用2.5%戊二醛固定液于4 冰箱中固定1 h2 h，经0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗后，在室温下用1%的四氧化锇固定液固定1 h2 h。B.2.3 脱漂和洗水 经0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗1 h，中间换液4次；用体积分数为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脱水各15 min（4）；室温下丙酮置换2次，各30 min。B.2.4 包埋和聚合 用Spurr低粘度环氧树脂进行渗透和包埋，分别用包埋剂：丙酮=1：1渗透1 h，包埋剂：丙酮=1：3渗透3 h后，置换新管，纯包埋剂渗透过夜。用纯包埋剂包埋后70 聚合8 h。B.2.5 超薄切片 包埋好的样品修块后，在超薄切片机上切成70 nm 90 nm的切片。DB33/T 7832010 3 B.2.6 电子染色 超薄切片分别经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色液各染色15 min。B.2.7 电镜观察 透射电镜下观察芋花叶病毒（DsMV）的线状粒子和风轮状内含体分布在细胞质中。黄瓜花叶病毒（CMV）的球状粒子分布在细胞质及液泡中。DB33/T 7832010 4 附 录 C（资料性附录）芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告 芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告参见表C.1。表 C.1 芋艿脱毒芋（苗）病毒检测报告 送样单位：品种名称：原种采集地：送样时间：原种数量:编 号：编号 芋花叶病毒（DsMV）黄瓜花叶病毒（CMV）注：病毒检测结果“+”表示阳性带毒，“-”表示阴性不带毒 检测单位：质检员（签字）：检测日期：