KJ 201710 蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、 敌敌畏残留的快速检测.docx

附件 蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、 敌敌畏残留的快速检测（KJ201710） 1　 范围 本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测方法。 本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速测定。 酶抑制（率）法（分光光度法） 2　 原理 在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。 3　 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1　 试剂 3.1.1　 丙酮（CH3COCH3）。 3.1.2　 磷酸氢二钾（K2HPO4）。 3.1.3　 磷酸二氢钾（KH2PO4）。 3.1.4　 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）。 3.1.5　 碳酸氢钠（NaHCO3）。 3.1.6　 碘化乙酰硫代胆碱（ C7H16INOS）。 3.1.7　 pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水中，混匀。 3.1.8　 显色剂：分别取160 mg 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。 3.1.9　 底物：取125 mg碘化乙酰硫代胆碱，加15 mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4 ℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。 3.1.10　 乙酰胆碱酯酶：4 ℃冰箱中保存备用。 3.2　 参考物质 3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥98%。 表1 有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、 CAS登录号、分子式、相对分子质量 序号 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量 1 克百威 Carbofuran 1563-66-2 C12H15NO3 221.25 2 灭多威 Methomyl 59669-26-0 C5H10N2O2S 162.23 3 丙溴磷 profenofos  41198-08-7 C11H15BrClO3PS 373.63 4 敌敌畏 Dichlorvos 62-73-7 C4H7Cl2O4P 220.98 5 敌百虫 Dipterex 52-68-6  C4H8Cl3O4P 257.44 3.3　 标准溶液的配制 3.3.1　 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液（1000 μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。 3.3.2　 丙溴磷标准储备液（100 μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。 3.3.3　 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准中间液A（100 μg/mL）：精密移取上述标准储备液（1000 μg/mL）（3.3.1）各1mL，分别置于10mL容量瓶中，用丙酮（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的标准液A。 3.3.4　 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫、丙溴磷标准中间液B（1 μg/mL）：精密移取标准中间液A（100 μg/mL）（3.3.3）及丙溴磷标准储备液（100 μg/mL）（3.3.2）各1 mL，分别置于100 mL容量瓶中，用缓冲溶液（3.1.7）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 μg/mL的标准中间液B。 4　 仪器和设备 4.1　 恒温水浴锅。 4.2　 天平：感量为0.1 g。 4.3　 分光光度计或相应商品化测定仪。 4.4　 环境条件：温度15 ℃～35 ℃，湿度≤80%。 5　 分析步骤 5.1　 试样的提取 5.1.1　 整株提取法 选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g（精确至0.1 g）置于表面皿中，加入10 mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min以上，取上清液备用。 5.1.2　 整体测定法 选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g（精确至0.1 g）放入离心管中，加入10 mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50 次，静置2 min以上，倒出提取液，静置3 min～5 min，待用。 5.2　 测定步骤 5.2.1　 对照液的测定 先于反应管中加入3 mL缓冲溶液（3.1.7），再加入适量酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37 ℃水浴锅中放置15 min。加入0.1 mL底物摇匀，立即测定吸光度，3min后再测定一次，记录反应3min的吸光度值的变化∆A0。 5.2.2　 样品液的测定 先于反应管中加入3 mL提取液，其他操作与对照液操作（5.2.1）相同，记录反应3 min的吸光度值的变化∆At。 5.3　 质控试验 每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.3.1　 空白试验 称取空白试样，按照5.1和5.2步骤与样品同法操作。 5.3.2　 加标质控试验 5.3.2.1　 韭菜、芹菜加标实验 取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3 g（精确至0.1 g）置于表面皿中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B（1 μg/mL）（3.3.4），加入10 mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min以上，取上清液备用。 其余操作按照5.2步骤同法操作。 5.3.2.2　 油菜、菠菜加标实验 取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取5 份试样各3 g（精确至0.1 g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），加入10 mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50 次，静置2 min以上，倒出提取液，静置3 min～5 min，待用。 其余操作按照5.2步骤同法操作。 6　 结果的表述 6.1　 结果计算 抑制率（%）=[（∆A0-∆At）/∆A0]×100 式中： ∆A0───对照溶液反应3 min吸光度的变化值； ∆At───样品溶液反应3 min吸光度的变化值； 6.2　 结果判定 结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。 当抑制率≥50%时，表示蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留高于检测限，判定为阳性，阳性结果的样品需要重复检验2 次以上。 6.3　 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。 7　 结论 当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。 8　 性能指标 8.1　 检测限：敌百虫0.1 mg/kg，丙溴磷0.5 mg/kg，灭多威0.2 mg/kg，克百威0.02 mg/kg，敌敌畏0.2 mg/kg。 8.2　 灵敏度：灵敏度应≥95% 8.3　 特异性：特异性应≥85%。 8.4　 假阴性率：假阴性率应≤5%。 8.5　 假阳性率：假阳性率应≤15%。 注：1.性能指标计算方法见附录A。 2.吸光度变化∆A0值应控制在0.2～0.3之间。具体的酶量，应根据产品说明书上标识的使用量，测定∆A0值。根据测定值，增加或减少酶量，使∆A0值控制在0.2～0.3之间。 检测卡法 9　 原理 样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而导致速测卡颜色深浅的变化。通过空白颜色比较，对样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药进行定性判定。 10　 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 10.1　 试剂 10.1.1　 丙酮（CH3COCH3）。 10.1.2　 磷酸氢二钾（K2HPO4）。 10.1.3　 磷酸二氢钾（KH2PO4）。 10.1.4　 pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9 g无水磷酸氢二钾及3.2 g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL水中，混匀。 10.2　 参考物质 同3.2。 10.3　 标准溶液的配制 同3.3。 10.4　 固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（检测卡）。 11　 仪器和设备 11.1　 恒温水浴锅。 11.2　 天平：感量为 0.1 g。 11.3　 环境条件：温度15 ℃～35 ℃，湿度≤80%。 12　 分析步骤 12.1　 试样的提取 12.1.1　 整株提取法 选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g（精确至0.1 g）置于表面皿中，加入10 mL缓冲液（10.1.4），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min以上。 12.1.2　 整体测定法 选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g（精确至0.1 g）放入小离心管中，加入10 mL缓冲溶液（10.1.4），振摇50 次，静置2 min以上。 12.2　 测定步骤 吸取2 滴左右待测液于白色药片反应区域，在37 ℃恒温装置中放置15 min进行预反应，预反应后的药片表面必须保持湿润。 将速测卡对折，手捏3 min或置于37 ℃恒温装置3 min，保证红色药片反应区域与白色药片反应区域完全叠合发生反应。 每次测定需有一个缓冲溶液的空白对照。 12.3　 质控试验 每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。 12.3.1　 空白试验 称取空白试样，按照 12.1 和 12.2 步骤与样品同法操作。 12.3.2　 加标质控试验 12.3.2.1　 韭菜、芹菜 取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3 g （精确至0.1g）置于表面皿中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。 12.3.2.2　 油菜、菠菜 选取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取5份试样各3 g（精确至0.1 g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。 13　 结果判定 白色药片区域不变色或略有浅蓝色为阳性结果；白色药片区域变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。通过对比空白和样品白色药片区域的颜色变化进行结果判定。目视判定示意图见图1。 13.1　 无效 白色药片区域干燥，表明取样量偏少，检测结果无效。 13.2　 阴性 样品白色药片区域颜色比空白对照卡颜色颜色相当或为天蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留低于方法检测限，判定为阴性。 13.3　 阳性 样品白色药片区域不变色或略有浅蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农残高于检测限，判定为阳性。 图1 目视判定示意图 13.4　 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。 14　 结论 当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。 15　 性能指标 15.1　 检测限：敌百虫0.1 mg/kg，丙溴磷0.5 mg/kg，灭多威0.2 mg/kg，克百威0.02 mg/kg，敌敌畏0.2 mg/kg。 15.2　 灵敏度：灵敏度应≥95% 15.3　 特异性：特异性应≥85%。 15.4　 假阴性率：假阴性率应≤5%。 15.5　 假阳性率：假阳性率应≤15%。 注：