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【GB 159991995】丁型病毒性肝炎诊断标准及处理原则 丁型病毒性肝炎诊断标准及处理原则 前 言 丁型病毒性肝炎(以下简称丁型肝炎)是由丁型肝炎病毒(HDV)引起的。HDV是一种缺陷的RNA病毒，HDV必须依赖乙型肝炎病毒(HBV)的辅助才能感染人体，并易导致重型肝炎、慢性肝炎及肝硬化。我国是HBV感染高发区，故HDV感染可累及威胁着许多HBV感染者，使其病情进一步加重。因而丁型肝炎的防治亦非常重要。为此制定适用于全国范围的丁型肝炎诊断标准及处理原则，对于丁型肝炎的防治工作有深远意义。本标准的附录A是标准的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：北京医科大学第一医院、北京地坛医院、北京佑安医院。本标准主要起草人：王勤环、徐道振、林秀玉。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。1 范围 本标准规定了丁型肝炎的诊断标准和处理原则。本标准适用于各级医疗卫生部门用于丁型肝炎的诊断及防治的依据。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB 159901995 乙型病毒性肝炎诊断标准及处理原则 3 定义 3.1 同时感染 coinfection 二种病原体同时感染。3.2 重叠感染 superinfection 在一种病原体感染的基础上又感染另一病原体。此处指在HBV感染基础上又感染HDV。4 诊断原则 须依据流行病学资料，临床症状体征和实验室检查来综合诊断。确诊则须依赖病人血清或肝组织HDV感染标记物的检测。必要时则须进行肝穿刺，对肝组织做病理组织学检查及免疫组化或分子杂交法做病原学检查。5 诊断标准 5.1 流行病学资料 同乙肝参照GB 15990 3.2.1.1a急性无黄疸型肝炎之流行病学资料，或与丁型肝炎病人有密切接触史，HBsAg阳性者更应注意。5.2 症状体征 5.2.1 HDV/HBV同时感染 大多数表现为急性自限性肝炎经过1)症状体征和急性乙型肝炎相同(参照GB 15990 中3.2.1.1 b)和 3.2.1.1 c)急性乙型肝炎诊断标准中的症状体征)，如病人有血清ALT及胆红素双相升高，更应怀疑为同时感染。少数病人表现为急性重型肝炎参照GB 15990 中 3.2.1.5 a)1)、2)急性乙型重型肝炎之症状体征。5.2.2 HDV/HBV重叠感染 原来为血清HBsAg阳性者(包括HBsAg携带者及慢性乙型肝炎病人)，病情突然活动，或进行性发展为肝硬化者，慢活肝或重型肝炎均应注意重叠HDV感染之可能。5.3 肝功能检测 同急性慢性或重型乙型肝炎之肝功能检测参照GB 15990 中 3.2.1.1 d)，3.2.1.3 b)，3.2.1.4c)和 3.2.1.5 a)中 3)急性、慢性、重型乙型肝炎之肝功能检测。5.4 HDV感染标记物检测 5.4.1 血清丁型肝炎病毒抗原(HDAg)见附录A中A3，必要时亦可检测肝内HDAg。5.4.2 血和(或)肝内HDVRNA。5.4.3 血清丁型肝炎病毒抗体：5.4.3.1 抗HDIgM见附录A中A1。5.4.3.2 抗HD见附录A中A2。5.5 HBV感染标记物检测，参照 GB 15990 附录A。上述 5 项中，5.5 中HBsAg阳性，5.4 项中一项或一项以上阳性及 5.3 中肝功能异常即可确诊为丁型肝炎，5.1 和 5.2 作为参考。在 5.4 及 5.5 中，如临床及病原学诊断符合急性乙型肝炎，伴HDV感染标记物中一项或一项以上阳性，可诊断为HDV/HBV同时感染；如临床及病原学诊断符合慢性乙型肝炎病毒感染，伴HDV感染标记物中一项或一项以上阳性，则可诊断为HDV/HBV重叠感染(参照GB 15990 附录A)。6 预防治疗原则 6.1 同乙型肝炎(参照GB 15990 中 4 及 5 章)。6.2 对住院病人中之丁型肝炎病人应进行隔离，以防止HDV在HBV阳性者中传播。附录A (标准的附录)HDV感染的特异性检测 本标准要求用ELISA法检测HDV感染标记物，要求使用卫生部批准的诊断试剂盒。A1 应用酶联免疫捕捉法检测抗HDIgM A1.1 原理 根据抗原抗体间特异性结合的原理，利用抗人免疫球蛋白IgM(最好用抗链)捕捉待测血清中的IgM，然后加入HDAg，使之与血清中抗HDIgM结合，然后利用酶标记的抗HDIgG，既具有与HDAg相反应的特性，又具有酶的催化放大活性。当加入相应底物后，酶使底物氧化，使无色底物变为有色，利用颜色深浅或OD值的高低来确定抗HDIgM的有无及含量。A1.2 材料 A1.2.1 聚苯乙烯塑料板：40 孔或 96 孔。A1.2.2 可变微量加样器：20L和 100L各一支。A1.2.3 抗人IgM(链)：鼠抗人IgM(链)单克隆抗体或兔(羊)抗人IgM(链)多克隆抗体。A1.2.4 HDAg：用基因工程抗原粗提液。A1.2.5 抗HDIgM阴性和阳性对照血清。A1.2.6 HRP抗HDIgG。A1.2.7 包被液：0.5m01/L pH9.59.6 的碳酸盐缓冲液(碳酸钠 15.9g，碳酸氢钠 29.3g)加水到 1000mL，110稀释使用。A1.2.8 洗液：0.01mol/L，pH7.27.4，PBS T(内含 0.85氯化钠，0.05Tween 20)。A1.2.9 稀释液：0.01mol/L，pH7.27.4，PBS，用于稀释血清和标记抗体。A1.2.10 底物液用前新配制。邻苯二胺(OPD)4mg，加基质液 10mL(磷酸盐 18.4g，柠檬酸钠 5.1g溶于 1000mL离子水中，pH5.0，4保存备用)。待用时溶化后加 3过氧化氢 50L混合均匀后立即使用。A1.2.11 终止剂：2mol/LH2SO4。A1.3 试验步骤 A1.3.1 用 0.05mol/L pH9.59.6 的磷酸盐缓冲液稀释抗人IgM(链)单克隆抗体，包被聚苯乙烯板，每孔 100L4过夜。A1.3.2 用PBS T洗三次，拍干。A1.3.3 每孔各加入 100L 11000稀释后的待检血清和阴阳性对照血清(阴性对照 3孔，阳性对照 2 孔)，37，1h。A1.3.4 负压下用PBS T洗板三次，抽干。A1.3.5 每孔加入 50100L经适当稀释后的HDAg24 个ELISA单位，放 45，1h。A1.3.6 洗三次后，每孔加入 50L HRP-抗HDIgG抗体(于含 10小牛血清的PBS中)，4245，1h。A1.3.7 洗三次后，加 50L新鲜配制的底物液，放室温暗处显色 1530min，当阳性对照显黄色后，每孔加入 1 滴(25L)2mol/L硫酸终止反应。A1.4 结果判断 A1.4.1 目测法：棕黄色，黄色为阳性；浅黄色可疑；无色阴性。A1.4.2 比色法：测定 492nm的OD值，并按式(A1)计算其S/N值，凡S/N大于 2.1 者为阳性；反之则为阴性。A1.5 意义 抗HDIgM阳性表示急性期或近期HDV感染；HDV/HBV同时感染抗HDIgM多呈短暂阳性；如二者重叠感染则多呈持续阳性；如同时检测抗HBcIgM及抗HBcIgG亦可用之区别HDV/HBV同时感染或是重叠感染，故抗HDIgM检测具有重要诊断价值。A2 酶联免疫吸附阻断法检测抗HD 抗HD总抗体其中主要是抗HDIgG。A2.1 原理 利用抗原抗体之间的特异性反应，测定待检血清中的抗体阻断酶标记抗HD与HDAg之间特异性结合的能力。A2.2 材料 A2.2.1 抗HDIgG多克隆或单克隆抗体用于包被。A2.2.2 抗HDV阳性、阴性对照血清。A2.2.3 HDAg，HRP抗HDIgG，包被液，稀释液及洗液等均同上。A2.3 试验步骤 A2.3.1 用包被液稀释抗HD抗体至适当浓度后包被聚苯乙烯板，每孔 100L，放 37，1h，4过夜。A2.3.2 负压下洗板二次抽干，每孔加入HDAg 50L，放 42，2h。A2.3.3 洗三次后每孔分别加入 110稀释的待检血清 50L和阴性、阳性对照血清(设3 孔阴性对照，2 孔阳性对照)，加入抗HDHRP 37，1h。A2.3.4 洗三次后，每孔加 50L新鲜配制的底物液放室温暗处显色 1530min，当阴性对照显色后每孔加 1 滴 2mol/L硫酸终止反应。A2.4 结果判断 目测法：无色或淡黄色为抗HD阳性；棕黄色或黄色为抗HD阴性。比色法：测定待测样品及阴性对照孔的OD429，按式(A2)计算阻断率。凡样品阻断率大于 50为阳性，反之为阴性。A2.5 意义 抗HD阳性表明曾有过HDV感染，如高滴度亦可表示为现在感染。A3 应用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测HDAg A3.1 原理 HDAg外面被HBsAg包裹，用除污剂(Tween 20 或NP40)裂解后才被释放出来。利用抗原抗体结合的免疫学原理，用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测HDAg。A3.2 材料 A3.2.1 抗HDIgG纯化抗体，用于包被。A3.2.2 抗HBc单克隆抗体，ELISA滴度 110万，用于稀释HRP抗HD。A3.2.3 10 Tween20。A3.2.4 HRP抗HD及其他材料同上。A3.3 试验步骤 A3.3.1 用包被液稀释抗HDIgG，包被聚苯乙烯板，每孔 100L，37，1h，4过夜。A3.3.2 洗三次后，每孔分别加入待测血清及阴性阳性对照血清 50L(阴性对照血清 3孔，阳性对照 2 孔)和 10Tween 2050L，充分混匀后放室温过夜，使之裂解HDV表面包裹的HBsAg而释出HDAg。洗三次后，每孔加入 50LHRP抗HD(稀释液中含 10小牛血清和10 个ELISA单位的抗HBc单克隆抗体)，放 45，1h(或 37，2h)。A3.3.3 洗三次后每孔加 50L新鲜配制的底物液放室温暗处显色 1530min后，每孔加25L2mol/L硫酸终止反应。A3.4 结果 目测法：棕色或黄色为HDAg阳性；无色为阴性。比色法：测定样品及阴性对照的OD492，按式(A3)计算S/N值，S/N值大于等于 2.1 为阳性。A3.5 意义 HDAg可存在于受感染的肝细胞和血中，HDAg阳性示体内有HDV复制。A3.6 注意事项 A3.6.1 HDV与HBV感染同时存在，血标本经除污剂处理后，HDAg与HBcAg仍可能同时存在，故要注意防止HBcAg的干扰，因而酶标记物中必须加入特异性中和HBcAg的单克隆抗体以排除之。A3.6.2 因外周血中HDAg量少，故检测血清至少要用 3050L。A3.6.3 若阴性对照OD值为 0，一般取 0.05 作为阴性对照值计算。