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【GB 159881995】布鲁氏菌病诊断标准及处理原则 布鲁氏菌病诊断标准及处理原则 1 主题内容与适用范围 本标准规定了人群布鲁氏菌病(简称布病)的诊断和疫区处理原则。本标准适用于各类医疗、卫生防疫机构。2 术语 皮肤过敏试验：受布氏菌感染后，再受到布氏菌过敏原刺激，皮肤出现的迟发型过敏反应。布病疫区：凡有新病人发生，或有疫畜检出的自然村(屯)或畜牧场(队)均视为布病疫区。检疫：用特异性的血清学，皮肤试验，分离细菌等方法对人畜布病的检查。淘汰：对查出的阳性畜进行屠宰处理。3 布病诊断 布病是一种严重地危害人民健康和畜牧业发展的人畜共患的传染病，染疫的家畜是人和畜间布病的主要传染源。3.1 流行病学：发病前病人与家畜或畜产品，布氏菌培养物有密切接触史，或生活在疫区的居民，或与菌苗生产、使用和研究有密切关系者。3.2 临床表现：出现持续数日乃至数周发热(包括低热)，多汗，肌肉和关节酸疼，乏力，兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。3.3 实验室检查：布病玻片或虎红平板凝集反应阳性或可疑，或皮肤过敏试验后 24、48h分别观察 1 次，皮肤红肿浸润范围有一次在 2.0cm2.0cm及以上(或 4.0cm2以上)。3.4 分离细菌：从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物中分离到布氏菌。3.5 血清学检查：标准试管凝集试验(SAT)滴度为 1100 及以上；对半年内有布氏菌苗接种史者，SAT滴度虽达 1100 及以上，过24 周后应再检查，滴度升高 4 倍及以上；或用补体结合试验(CFT)检查，CFT滴度 110 及以上；抗人免疫球蛋白实验(Coombs)滴度1400 及以上。疑似病例：具备 3.1、3.2 和 3.3 者。确诊病例：疑似病例加 3.4 或 3.5 中任何一种方法阳性者。4 疫区处理原则 4.1 核实诊断：对确诊的病人应依据流行病学资料，临床表现和实验室检查结果进行核实诊断。4.2 检疫和淘汰处理疫畜：对疫区内全部羊，牛和猪用血清学方法进行检疫，检疫后 1 个月再检一次。凡检出的阳性家畜均应立即屠宰(或隔离饲养)。至少在一年内停止向外调运牛、羊、猪。畜产品均应在原地存放和消毒，暂不外运。4.3 消毒：被病畜的流产物污染的场地、用具、圈舍及尚未食用的奶制品均应进行消毒处理。4.4 免疫：经两次检疫呈阴性反应的家畜，以及疫区周围村受威害的畜群，应连续 3 年以畜用菌苗进行免疫，每年免疫覆盖率不应低于 90。4.5 临床监测及治疗：对疫区内接触家畜及畜产品的人员进行血清学及皮肤过敏试验，查明人群感染情况，凡确诊的病人均应进行系统治疗。4.6 宣传教育：对疫区的居民及职业人群进行布病的危害、临床表现及防治知识的宣传教育。4.7 疫区处理效果验证：在疫区处理后的第二年始，连续三年对疫区及疫区周围地区进行验证，验证方法按照农业部和卫生部共同制定的布病疫区控制考核标准的要求进行。附录A 布鲁氏菌病诊断的特异性实验室检查技术 (补充件)A1 从可疑布病患者分离布鲁氏菌 A1.1 血培养 A1.1.1 双相培养基培养：无菌从可疑病人静脉取血液 45mL，在酒精灯火焰附近将血液注入 56 支含双相培养基的中试管内，或24 只含双相培基烧瓶中，轻轻混合倾斜，使被检血液分布在琼脂斜面上，置 37温箱培养，如果怀疑病人是牛种布鲁氏菌感染时，应有一半标本置CO2环境中培养，三天后观察结果，如未见布氏菌生长，可按上法再倾斜，使血液涂在琼脂斜面上，继续培养，每隔一天观察一次，如有可疑布鲁氏菌落，可用铂金耳勾出接种到琼脂试管培基，获得纯培养，进一步作布氏菌鉴定，血培养二十天仍不出菌，可定为阴性。A1.1.2 接种未受精鸡卵法：取新鲜鸡蛋两个，把鸡蛋放在固定架上，锐端向上，以碘酒和酒精依次消毒蛋壳，用眼科手术刀在顶部穿一小孔，用三厘米长注射针头将被检血液徐徐注入卵黄中，每个鸡蛋接种血液 0.2mL，立即用灭菌石蜡将孔密封，置 37温箱中培养，五天后把接种血液的鸡蛋无菌打开，用灭菌的毛细管把接种血液部分的卵黄及蛋清吸出 0.50.6mL，接种 23 支斜面培养基上，置 37培养，23 天观察一次，15 天仍不见可疑菌落生长，定为阴性。A1.2 骨髓培养 用灭菌的导尿管将尿液导出放入灭菌容器中，为浓缩细菌，提高检出率，可在尿液中加入 13的高价布鲁氏菌免疫血清，混合后，置 37温箱 2h，高速离心沉淀，取沉淀物 0.5mL接种在选择性培基上培养，或注射豚鼠，用生物学法分离布鲁氏菌。A1.3 其他病原材料培养 由乳，脑脊液，关节液和滑囊液分离布鲁氏菌，将液体标本无菌地接种到琼脂斜面上，或培养平板上，涂布于培基表面，参照血培养法观察结果，15 天仍无可疑菌生长，定为阴性。A1.4 生物学分离布鲁氏菌法 为了提高对布鲁氏菌的检出率和从污染的材料中分离布鲁氏菌，将被检材料(固体标本加灭菌的生理盐水研碾成浆液态)经皮下或腹腔注射豚鼠或小白鼠，豚鼠接种 1mL，小鼠接种 0.5mL，接种豚鼠，即可观察血清变态反应情况，又可作细菌分离培养，小鼠感染后二十天解剖取脏器培养，豚鼠接种后三十天解剖取脏器培养。A2 特异性血清学检查 A2.1 平板凝集试验(PAT)A2.1.1 器材及试剂 赫德逊氏凹玻板或一块清洁无油脂玻璃板，平板凝集抗原，被检血清，已知阴性和阳性血清，0.1mL吸管或微量加样器，牙签或细铁丝。A2.1.2 操作方法 A2.1.2.1 备方形洁净的玻璃板，划成 25 个方格(或更多)，横数 5 格，纵数 5 格，第一列各格写下血清号码。A2.1.2.2 用 0.1mL吸管按下列剂量加受检血清于任何一行(横格)的各格中：第一格 0.08mL，第二格 0.04mL，第三格 0.02mL，第四格 0.01mL。A2.1.2.3 加平板凝集抗原 0.03mL于各血清格中，用牙签或细铁丝混合，由血清量最小的格混起，每份血清用一根牙签混合即可，用后烧毁，若用细铁丝混合时，每份血清混合后用酒精棉球擦净，然后再用作另一份血清。A2.1.2.4 混匀后将玻璃板置于酒精灯火焰或凝集反应箱上，均匀加温，使其达到 30左右，5min内记录反应结果。A2.1.2.5 每次试验用阴、阳性血清各 1 份作对照。A2.1.2.6 按下列标准用加号记录反应强度：出现大的凝集片或小的粒状物，液体完全透明，100凝集。：有明显的凝集片，液体几乎完全透明，75凝集。：有可见的凝集片，液体不甚透明，50凝集。：液体混浊，只有少量粒状物，25凝集。：液体均匀混浊。A2.1.2.7 平板凝集反应与试管凝集反应的关系：0.08mL 血清量出现凝集相当于试管法 125 的血清稀释度，0.04mL相当于 150，0.02mL相当于 1100，0.01mL相当于 1200。A2.1.3 判定 人血清 0.02mL出现及以上凝集程度判为阳性，人血清0.04mL出现及以上凝集程度判为可疑。A2.2 虎红平板凝集试验(RBPT)A2.2.1 器材及试剂 清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1mL吸管或微量加样器，牙签或细铁丝，虎红平板凝集抗原，被检血清。A2.2.2 操作方法 在玻片上加 0.03mL被检血清，然后加入虎红平板抗原 0.03mL，摇匀或用牙签混匀，在 5min内判定结果。A2.2.3 判定 判定凝集程度(至)同平板凝集反应亦可只分为()阳性，()阴性两类。A2.3 试管凝集试验(SAT)A2.3.1 器材及试剂 试管凝集抗原，被检血清，0.5的石碳酸生理盐水，吸管，凝集试管，温箱和试管架等。A2.3.2 操作方法 A2.3.2.1 被检血清的稀释：在一般情况下，每份血清用 5 支小试管(口径 810mm)，第一管加入 2.3mL石碳酸生理盐水，第二试管不加，第三、四、五管各加 0.5mL，用 1mL吸管吸取被检血清 0.2mL，加入第一管中，混匀。混匀后，以该吸管吸取第一管中血清加入第二管和第三管各 0.5mL，以该吸管将第三管混匀，并吸取 0.5mL加入第四管，混匀。再从第四管吸取 0.5mL，弃去。如此稀释后，从第二管到第五管血清稀释度分别为 112.5，125，150 和 1100。A2.3.2.2 加入抗原：先以 0.5石碳酸生理盐水将抗原原液作适当稀释(一般是作 110 稀释)。稀释后的抗原加入各稀释的血清管(第一管不加，作为血清对照)，每管加 0.5mL，混匀。加入抗原后，每管总量 1mL，血清稀释度从第二管至第五管分别为 125，150，1100 和 1200，从第一管再吸出 0.5mL，剩 1mL。A2.3.2.3 对照：阴性血清对照，血清稀释后加抗原(与被检血清对照相似)。阳性血清对照，其血清稀释到原有滴度，再加抗原，抗原对照，适当稀释的抗原加石碳酸盐水。A2.3.3 判定 A2.3.3.1 判定比浊管制备：每次试验须配制比浊管作为判定的依据。配制方法是：取本次试验用的抗原稀释液 510mL，加入等量的 0.5碳酸盐水作倍比稀释，按表A1 配制比浊管。表A1 比浊管配制 A2.3.3.2 全部试验管，对照管及比浊管充分振荡后置 37温箱中 2022h，取出后放室温 2h，然后以比浊管为标准判定结果。A2.3.3.3 记录结果：根据各管中上层液体的清亮度记录结果。特别是 50清亮度()对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。：完全凝集，上层液 100清亮。：几乎完全凝集，上层液 75清亮。：显著凝集，液体 50清亮。：有微量凝集，液体 25清亮。：无凝集，液体不清亮。确定每份血清滴度是以出现十十及以上的凝集现象的最高血清稀释度。A2.4 抗人免疫球蛋白试验(COOMBS)A2.4.1 器材及试剂 除试管凝集试验所需的一般器材及试剂外，还需抗人免疫球蛋白血清及普通离心机。A2.4.2 操作方法 A2.4.2.1 试管凝集试验阶段：按A2.3 进行试管凝集试验。A2.4.2.2 抗免疫球蛋白的反应阶段：选取试管凝集试验的可疑反应管及全部阴性反应管，记录管号，经 4000r/min离心 15min，用生理盐水反复洗涤三次，然后向各管中加入生理盐水 0.5mL、一定稀释度(一般是 120 倍稀释)的抗人免疫球蛋白血清，混匀，将反应管置 37温箱中 2022h，取出放室温 2h后判定结果。A2.4.2.3 判定：判定结果的标准，程度均同试管凝集试验。A2.5 补体结合试验(CFT)A2.5.1 器材及试剂 37水浴箱，普通离心机，普通冰箱，各种容量的吸管，烧瓶，凝集管和试管架，生理盐水，补体(新鲜豚鼠血清，或冻干补体)，2的绵羊红细胞悬液，溶血素，补体结合抗原，阴性和阳性血清，被检血清。A2.5.2 操作方法 A2.5.2.1 补体滴度：在进行CFT时，必须当天滴定补体，将补体用生理盐水稀释为 120，通常在十支凝集管中分别依次加入不同量的 120 稀释补体 0.020.2mL，然后各管中加入 2 个单位的抗原液 0.2mL，再用生理盐水把各管补至 0.6mL，混匀后放 37水浴中30min，再加 0.2mL的溶血素(2 个单位)和 2红细胞 0.2mL，混匀，置 37水浴中 30min，判定结果(见表A2)。表A2 补体滴度程序和结果 mL 上例中产生完全溶血且合补体量最少管为第八管，定为一个恰定单位，前一管(即第七管)为一个完全单位。在正式试验时采用两个完全单位的补体量，按式(A1)计算出补体稀释倍数X。202YX0.2(A1)式中：Y1 个完全单位补体量。A2.5.2.2 溶血素及抗原滴定：在进行CFT时溶血素和抗原亦需滴定，但不必在试验当天进行；而且，在购到此二试剂时出售单位(或提供单位)都已滴定了，需用单位按说明稀释即可。A2.5.2.3 被检血清灭活：人血清灭活补体的温度是 56，时间为 30min。A2.5.2.4 本试验：灭活后的被检血清从 15 稀释开始，然后作倍比稀释，每管中稀释血清量为 0.2mL，再向各管中加 2 个单位抗原 0.2mL，2 个单位补体量 0.2mL，混匀，置 37水浴中 30min，取出后，向各管加 0.4mL的溶血素，再放 37水