GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法.pdf

中华 人 民共 和 国国家 标准农药 登记毒理 学试验 方法G s 1 5 6 7 0 一 1 9 9 5T o x i c o l o g i c a l t e s t m e t h o d s o f p e s t i c i d e s f o r r e g i s t r a t i o n1 主题内容与适用范围 本标准规定了农药登记毒理学试验的方法、条件的基本要求。本标准适用于为农药登记而进行的毒理学试验。2 急性经口 毒性试验2.1 目的 求出试验农药对试验动物的半数致死剂量(L D O;通过观察急性毒性效应的临床表现，初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机理;为亚慢性、慢性和其他毒性试验的剂量水平设计提供参考;为急性毒性分级和制定安全防护措施提供依据。2.2 试验农药 原药和制剂。2.3 试验动物2.3.1 主要选用品系、遗传背景明确的初成年大鼠。各剂量组内同性别动物体重差异应小于平均体重的1 0 0 0，组间同性别动物体重均值差异应小于5 0 0,2.3.2 每一剂量组的大鼠8-1 0 只(雌雄各半)，试验前要对动物观察一周，确认健康后，方可使用。2.4 剂量分组2.4.1 至少应设4-5 个剂量组，各剂量组之间要有适当的剂量间 距。以 便各组出现不同程度的毒性效应(死亡率)，求得剂量效应曲线及L D 5 o,2.4.2 如剂量达5 0 0 0 m g/k g 体重以上，动物仍不出现死亡，则不需要进行更高剂量的试验。2.5 给药方法及观察时间2.5.1 动物给药前应隔夜禁食但不禁水，称重后，一次灌胃给药，给药后至少间隔2 h进食。2.5.2 灌胃量 大鼠 按1 0 0 g 体重给1 m L，小鼠 按2 0 g 体重给。.4 m L 计算，灌胃 可用水溶液、油溶液或悬液。2.5.3 给药后立即观察并记录动物的中毒表现，症状出现和消失的时间及死亡时间。给药当日 应连续观察，其后，每日 至少观察2 次，观察期为1 4 d。如在给药9 6 h 后出 现迟发性新效应，则应延长观察期至3 周或4 周。2.6 观察指标2.6.1 中毒症状 全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官。观察的系统包括:a.中枢神经系统和神经肌肉系统:体位异常、叫 声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝;国家技术监份局1 9 9 5 一 0 8 门7 批准1 9 9 6 一 0 1 一 0 1 实施G B 1 5 6 7 0 一 1 9 9 5 b.植物神经系统:瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪;c.呼吸系统:鼻孔流液、鼻冀煽动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰;d.泌尿生殖系统:会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀;e皮肤和毛:皮肤充血、紫纷、被毛蓬松、污秽;f.眼:眼球突出、结膜充血、角膜混浊;g.消化系统:腹泄、厌食。2.6.2 体重 给药前、死亡时各称量一次体重，观察期间每3 d 称量一次。2.6.3 一般不做病理组织学检查和生化指标检验，但对死亡动物应做大体病理学观察。如2 4 h 以上的存活动物，肉眼检查有病变时应做病理组织学检查。2.了 结果评定2.7.1 用统计方法计算L D,。值。计算方法见附录A(补充件)。2.7.2 按农药的急性经口毒性分级标准进行评定(见表1),表 1 急性经口毒性分级标准经口L D,m g/k g 5 0 0别-毒毒毒毒级-剧高中低3 急性经皮毒性试验3.1 目的 了解农药对试验动物皮肤直接接触引起局部皮肤损伤、全身中毒的特征等毒性效应，求出半数致死剂量(L D 5 o)，为制定农药生产和应用中的防护措施提供依据。3.2 试验农药 原药和制剂。3.3 试验动物3.3.1 为有足够的涂药面积，首选成年大鼠，体重要求2 0 0-3 0 0 9.3.3.2 各剂量组大鼠8-1 0只(雌雄各半)。3.4 剂量分组3.4.1 至少应设4 个剂量组，各剂量组应有一定的间距，使给药组能出现毒性表现和死亡。3.4.2 如果2 0 0 0 m g/k g 剂量仍不出现死亡时，则不需要再进行高剂量试验。3.5 给药方法及观察时间3.5.1 给药前 2 4 h 背部去毛，注意勿损伤皮肤，涂药面积应占体表面积 1 0%，大鼠4 X5 c m ，兔1 2 X1 4 c m，豚鼠7 X 1 0 c m.3.5.2 液体农药用原药液，粉末农药用水或溶剂稀释。3.5.3 先将动物固定，在略小于剃毛面积内进行定量敷药，然后覆盖一个与脱毛面积相当的盒式罩，再用胶布固定。以防止动物舔食试验药品.;:涂药持续时间为4 h,涂药4 h 后取下罩盒，用温水洗去皮肤上的试验农药，再进行局部观察。;“观察时间为2 周。观察指标G B 1 5 6 7 0 一 1 9 9 53.6.13.6.23.73.7.13.7.2中毒的临床表现，参照2.6.1,死亡时间及死亡率。结果评定用统计方法计算L D s。值。计算方法见附录A(补充件)。按农药的急性经皮毒性分级标准进行评定(见表2),表 2 急性经皮毒性分级标准经皮L D,o(4 h),m g/k g 2 0 0 0毒毒中低4 急性吸人毒性试验4.飞 目的 测试可能经呼吸道进入机体的农药(尤其是挥发性强的农药)对呼吸道及全身的损伤及其危害程度。求出吸入接触的半数致死浓度(I.C s o)，为农药的安全评价和制定生产应用中的防护措施提供依据。4.2 试验农药 原药和制剂。4.3 试验动物4.3.1 一种以上的哺乳动物，大鼠为首选动物.4.3.2 动物性别、体重和每组动物数量的要求同2.3,4.4 剂量分组4.4.1 至少应设3 个出现毒性效应直至死亡的剂量组。4.4.2 如果以浓度2 0 0 0 m g/m，给药2 h 仍无死亡，则无需再做高浓度试验。4.5 给药方法及观察时间4.5.1 给药方式包括鼻、头部接触和全身置于染毒柜内接触两种方式。4.5.2 染毒柜内应保持恒定的空气流量、农药浓度、温度及湿度，并要求柜内保持轻微负压以免农药外漏。4.5.3 吸入给药一般为2 h o4.5.4 给药后至少观察1 4 d.4.6 观察指标4.6.1 中毒的临床表现，参照2.6.1,4.6.2 死亡时间及死亡率。4.7 结果评定4.7.1 用统计方法计算L C s o 值。计算方法见附录A(补充件)。4.7.2 按农药的急性吸入毒性分级标准进行评定(见表3),表 3 急性吸入毒性分级标准L c,o(2 h),m g/m 2 0 0 0毒毒毒高中G B 1 5 6 7 0 一 1 9 9 55 急性皮肤刺激试验5.1 目的 测定农药对哺乳动物皮肤是否有刺激或腐蚀作用，估计人体接触该农药时可能出现的类似危害。5.2 试验农药 原药和制剂。5.3 试验动物5.3 门兔或豚鼠，首选动物为白色家兔。5.3.2 至少4 只皮肤完好的健康动物。5.4 剂量5.4.1 一次涂药量为0.5 m L或。.5 g.5.4.2 动物自身皮肤做为对照。5.5 试验步骤5.5.1 试验前 2 4 h将背部毛剪掉，面积约6 c m 2.5.5.2 涂上试验农药，再用纱布盖上，以胶布固定或采用其他封闭性盖罩，避免试验动物舔食。5.5.3 涂敷持续时间一般为4 h。试验结束时，用水或适当的溶剂洗去残留的农药，但注意不要损伤皮肤。5.5.4 根据需要做进一步的观察，以确定反应的可逆性。一般观察期不超过 1 4 d,5.6 结果评定 每一只动物试验结果按表4 进行刺激反应评分，计算出平均分值，按表5 进行强度评定。表 4 皮肤刺激反应评分症状及程度积分红斑形成无红斑勉强可见明显红斑中等至严重红斑紫红色斑并有焦A A 形成水肿形成无水肿勉强可见水肿隆起轮廓清楚水月 中 隆起约 1水肿隆起超过总分1 m m，范围扩大A十BG s 1 5 6 7 0 一 1 9 9 5表 5 皮肤刺激强度分级强度分值无刺激性轻度刺激性中等刺激性强刺激性 0-0.40.5 1.92.0-5.96.0-8.0注:P H 蕊2 或P H)l l.5 的农药可不进行本试验.6 眼刺激试验61 目的 了 解试验农药对眼睛的刺激作用和程度，为农药生产和使用中的安全防护提供依据。6.2 试验农药 原药和制剂，但对具有强酸、强碱性质的化合物(p H-1 1.5)不需做此试验。6.3 试验动物 成年的白色家兔至少4 只。试验前2 4 h 检查试验家兔双眼，有异常者不得使用。64 剂量 液体农药或1 0。倍稀释液。.1 m L,粒状农药不超过1 0 0 m g，且应先将颗粒磨成细粉。6.5 给药方法及观察时间6.5.1 将一侧下眼睑轻轻下拉，把试验农药滴人结膜囊内，为防止药液外溢，立即轻轻闭合眼睑约1 m i n。如用喷雾给药法，将眼睑分开.在眼前方1 0 c m距离处迅速喷雾1 s,6.5.2 给药后 2 4 h内不洗眼。6.5.3 对侧眼为对照，6.5.4 给药后于1,2 4,4 8,7 2 h 分别检查眼晴。如7 2 h 仍无刺激反应时，则终止试验。6.5.5 如果出现角膜损伤或眼睛其他部位出现反应，要继续观察损伤的经过及其可逆性，观察期最长不超过2 1 d,6.5.6 7 2 h 刺激反应仍不消退时，至少另选4 只家兔观察洗眼效果。即滴入药物后分别在4 s 和3 0 s时用生理盐水洗眼5 m i n，观察洗眼后的眼睛反应情况。6.6 观察指标 除了观察结膜、角膜、虹膜外，还应注意其他部位的损害。6.7 结果评定 按表 6 将每只动物的角膜、虹膜和结膜的刺激反应的分值相加，即是一只动物眼刺激反应的总积分。每个动物的刺激反应积分的总和除以动物数，就是该试验农药对眼刺 激性的最后分值。再按表7 评定眼刺激程度.表 6 眼损伤程度评分部位及程度积分角膜A 混浊(以最致密部位为准)无混浊 散在或弥慢性混浊，虹膜清晰可见一G B 1 5 6 7 0 一 1 9 9 5续表 6部位及程度积分 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清 角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认B 角膜受报范围 再进行毒性效应的测试8.7 临床观察和检查8.7.1 观察给药期间和给药后试验动物的毒性效应、出现时间、持续时间和程度。如发现濒死动物应及时解剖。每周至少测量一次进食量(或饮水量)和体重。8.72 血液学检查 检测项目 包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞数及其分类等。8.7.3 血液生化检查 检测项目一般应包括肝、肾 功能，如血清天冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、尿素氮、肌醉等。必要时还须检测总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇、总胆红素、高铁血红蛋白、胆碱醋酶、钾、钠、钙、磷等。8.8 病理学检查G B 1 5 6 7 0 一1 9 9 58.8.1 系统解剖 所有试验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和仔细的肉眼观察。肉眼可见的损伤或可疑损伤部位都应采样固定，作进一步组织学检查。8.8.2 脏器重量 称取脾、肝、肾、肾 上腺、擎丸等脏器重量并计算其脏器系数(脏器重/体重x 1 0 0%),8.8.3 组织学检查 对照组和高剂量组动物以及系统解剖时发现的异常组织均需作详细的组织学检查。其他剂量组一般仅在高剂量组有异常发现时进行。附加组动物应对试验组已确证有毒性效应的组织和器官重点检查。检查脏器一般包括脑、肝、脾、肾、肾上腺、辜丸、卵巢和其他肉眼观察发现有损害或大小出现变化的器官。一般以肝、肾及可疑靶器官为主。此外，还应包括与农药直接接触的组织或器官，如胃 等。9 亚急性经皮毒性试验9.1 目的 按经皮方式反复给药2 1 d，观察由 此产生的不良反应，求出无作用剂量。9.2 试验农药 原药。9.3 试验动物 按8.3 进行。9.4 剂量分组9.4.1 一般设三个剂量组和一个对照组。必要时还应设溶剂对照组。9.4.2 最高剂量组应出现明显的中毒效应，但死亡动物数不能妨碍有效的评定。9.4.3 如果用1 0 0 0 m g/k g 体重以上的剂量给药而未出现任何毒性效应，则不必再设其他更高剂量组。9.5 给药方法9.5