GB 15193.4-1994 鼠伤寒沙门氏菌 哺乳动物微粒体酶试验.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验G B 1 5 1 9 3.4 一 9 4S a l m o n e l l a t y p h i mu r i u m/ma m ma l sm i c r o s o ma l e n z y me t e s t(A m e s t e s t)主题内容与适用范围本标准规定了A m e s 试验的基本技术要求。本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。2 原理 鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联笨(P C B)诱导的大鼠肝匀浆(S-9)制备的S-9 混合液。3 仪器3.1 实验室常用设备。3.2 低温高速离心机，低温冰箱(-8 0 C)或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。4 培养墓制备及试剂的配制 培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4 不超过六个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。4.1 营养肉汤培养基 牛肉 膏2.5 g 胰陈(或混合蛋白 陈)5.0 g 氯化钠2.5 g 磷酸氢二钾(K 2 H P 0,3 H 2 0)1.3 g 蒸馏水5 0 0 m L 加热溶解，调p H至7.4，分装后。.1 0 3 MP a 2 0 m i n 灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。4.2 营养肉汤琼脂培养基:用作a基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨节青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b.细菌活力鉴定。琼脂粉1.5 g 营养肉汤培养基1 0 0 m L一 一，一.-.一一一-一.，一一 目.一，一.-一.-一叫 一一 一.一 一 一，-中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 8 一 1 0 批准1 9 9 4 一 0 8 门0 实施G s 1 5 1 9 3.4 一 9 4 加热融化后调p H为7.4,0.1 0 3 M P a 2 0 m i n 灭菌。4.3 底层培养基所需试剂及配制方法如下:4.3.1 磷酸盐贮备液 磷酸氢钠钱(N a N H 4 H P 0 4 4 H 2 0)1 7.5 g 柠檬酸(C 6 H a 0 7 H 2 0)1 0.0 g 磷酸氢二钾(K H P O O 5 0.0 g 硫酸镁o(Mg S 0 4 7 H O)1.0 g 加蒸馏水至1 0 0 m L,O.1 0 3 MP a 2 0 m i n 灭菌。注:1)待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中 继续溶解，否则易析出沉淀。4.3.2 4 0%葡萄糖溶液 葡萄糖4 0.0 g 加蒸馏水至1 0 0 m L,0.0 5 5 M P a 2 0 m i n 灭菌。4.3.3 1.5%琼脂培养基 琼脂粉6.0 9 蒸馏水4 0 0 mL 融化后0.1 0 3 MP a 2 0 m i n 灭菌。4.3.4 底层培养基(无菌操作)趁热(8 0 C)，在灭菌琼脂培养基中(4 0 0 m L)依次加人:磷酸盐贮备液8 m L 4 0%葡萄糖溶液2 0 m L 充分混匀，待凉至8 0 左右时倒平皿，每皿.9 0 m m)2 5 m L,3 7 培养过夜以除去水分及检查有无污染.4.4 顶层培养基的成分及制备4.4.1 顶层琼脂 琼脂粉3.0 g 氯化钠2.5 9 加蒸馏水至5 0 0 m L4.4.2 0.5 m m o l/L组氨酸一 生物素溶液(诱变试验用)D 一 生物素(分子量2 4 4)3 0.5 m g L 一 组氨酸(分子量1 5 5)1 7.4 m g 加蒸馏水至2 5 0 m L,4.4.3 顶层培养基制备:加热融化顶层琼脂，每1 0 0 m L顶层琼脂中加1 0 m L 1 0.5 m o l/L组氨酸一 生物素溶液。混匀，分装在1 0 0 m L三角瓶中，0.1 0 3 MP a 2 0 m i n 灭菌。用时融化分装小试管，每管2 m L,在4 5 水浴中保温。4.5 特殊试剂和培养基的配制4.5.1 0.8%氨节青霉素溶液(鉴定菌株用，无菌配制)称取氨苇青霉素4 0 m g，用。0 2 m o l/L氢氧化钠溶液稀释至5 m L，保存于冰箱。4.5.2 0.1%结晶紫溶液(鉴定菌株用)称取1 0 0 m g 结晶紫，溶于1 0 0 m L无菌水。4.5.3 L 一 组氨酸溶液和。.5 m o l/L D 一 生物素溶液(鉴定菌株用)称取L 一 组氨酸0.4 0 4 3 g 和D 一 生物素1 2.2 m g，分别溶于1 0 0 m L蒸馏水，0.1 0 3 M P a 2 0 m i n 灭菌，保存于4 冰箱。4.5.4 0.8%四环素溶液(用于四环素抗性试验和氨节青霉素一 四环素平板)G s 1 5 1 9 3.4 一 9 4称取4 0 m g 四环素，用。.0 2 m o l/L盐酸稀释至5 m L，保存于4 冰箱。4.5.5 氨节青霉素平板(用作T A 9 7,T A 9 8,T A 1 0。菌株的主平板)和氨节青霉素一 四环素平板(用作T A 1 0 2 菌株的主平板)每1 0 0 0 m L中由以下成分组成:底层培养基9 1 0 m L 磷酸盐贮备液2 0 m L 4 0%葡萄糖溶液5 0 mL 组氨酸水溶液(0.4 0 4 3 g/1 0 0 m L)1 0 m L 。.5 mo l/L生物素6 m L 。.8%氨节青霉素溶液3.1 5 m L 0.8%四环素溶液0.2 5 mL 四环素仅在使用对四环素有抗性的T A 1 0 2 时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。4.5.6 组氨酸一 生物素平板(组氨酸需要试验用)每1 0 0 0 m L中由以下成分组成:底层培养基9 1 4 m L 磷酸盐贮备液2 0 m L 4 0%葡萄糖溶液5 0 m L 组氨酸水溶液(0.4 0 4 3 g/1 0 0 m L)1 0 m L 0.5 m o l/L生物素6 m L 以上成分均已 分别灭菌。4.5.7 二甲 基亚矾:光谱纯，0.1 0 3 M P a 2 0 m i n 灭菌。4.6 S-9 辅助因子(混合掖试剂)的配制4.6.1 0.4 m o l/L 氯化镁(M g c l z)溶液:称取3.8 g，加蒸馏水稀释至1 0 0 m L,4.6.2 1.6 5 m o l/L氯化钾(K C l)溶液:称取1 2.3 g，加燕馏水稀释至1 0 0 m L,4.6.3。，2 m o l 磷酸盐缓冲液(p H 7.4)，每5 0 0 m L由以下成分组成:磷酸氢二钠(N a,H P O,)(1 4.2 g/5 0 0 m L)4 4 0 m L 磷酸 二氢钠(N a H I P 0,H,O)(1 3.8 g/5 0 0 m L)6 0 m L 调p H至7.4,0.1 0 3 MP a 2 0 m i n 灭菌或滤菌。4.6.4 辅酶一 H(氧化型)溶液:准确称取辅酶一 H，用无菌蒸馏水溶解配制成0.0 2 5 m o l/L溶液，低温保存(一2 0 以下)。4.6.5 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液:称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌燕馏水溶解配制成。.0 5 m o l/L，低温保存(一2 0 0C以下)。4.7 l o a n s-9 混合液的配制:每 1 0 m L由以下成分组成，临用时配制。磷酸盐缓冲液(0.2-m o l/L,p H 7.4)6.0 m L 氯化钾溶液(1.6 5 m o l/L)。.2 m L 氯化镁溶液(0.4 m o l/L)0.2 m L 葡萄糖-6-磷酸盐溶液(0.0 5 m o l/L)1.0 m L 辅酶 Q 溶液(0.0 2 5 mo l/L)1.6 mL 肝 S-9 液1.0 mL 混匀，置冰浴中待用。5 活化系统(S-9 和S-9 混合液)的制备 用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆 9 0 0 0 9 离心，上清液为S-9 组分，与辅助成分以适当比例组成S-9 混合液，用作试验中的代谢活化系统。5.1 大鼠肝S-9 的诱导和制备G B 1 5 1 9 3.4 一9 45.1.1 选健康雄性成年 S D或 Wi s t a r 大白鼠，体重 1 5 0 g 左右，周龄约 5-6 周。将多氯联苯(A r o-c l o r 1 2 5 4 或国产P C B 一 五氯)溶于玉米油中，浓度为2 0 0 m g/m L，按5 0 0 m g/k g(体重)无菌操作一次腹腔注射，5 d 后断头处死动物，取出肝脏称重后，用新鲜冰冷的 0.1 5 m o l/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加。.1 m o l/I氯化钾溶液3 m L，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器(低于4 0 0 0 r/m i n，往复1-2 m i n)，或组织匀浆器(2 0 0 0 0 r/m i n,l m i n)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。5.1.2 将制成的肝匀浆在低温(0-4 C)高速离心机上，以9 0 0 0 g 离心1 0 m i n，吸出上清液为S-9 组分，分装于无菌冷冻管或安瓶中，每安瓶2 m L左右，最好用液氮或干冰速冻后置-8 0 0C 低温保存。5.1.3 S-9 制成后，经无菌检查，蛋白含量测定(L o w r y 法)，每毫升蛋白含量应不超过4 0 m g 为宜，因过量蛋白将会抑制回复突变率，并经间接致癌物(诱变剂)鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。5.2 S-9 混合液配制 由S-9 液和辅助因子(S-9 混合液试剂)组成，辅助因子按A m e s(1 9 8 3)配方，低温(-2 0 以下)贮存。混合液临用时新鲜无菌配制，或滤过除菌。一般按1:9 配成1 0 Y O 混合液。用每皿。.5 m L S-9 混合液(含2 0-5 0 p L S-9)测定其对已 知阳性致癌物(诱变剂)的生物活 性，确定最适用量，或者按一般用量，即每平皿。.5 m LS-9 混合液(含S-9 5 0 p L),S-9 活性和用量应在报告中 予以说明。6 菌株及其鉴定和保存6.1 采用四株鼠伤寒沙门氏茵突变型菌株T A 9 7,T A 9 8.T A 1 0 0,T A 1 0 2.,T A 9 7 和T A 9 8 可检测各种移码型诱变剂;T A 1 0。可检测引起碱基对置换的诱变剂;T A 1 0 2 能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霹素C等交联剂。一般用来侧试受试物诱变性时，必须通过四个菌株的检测。必要时可增加T A 1 5 3 5,T A 1 5 3 7 或T A 1 0 4 任一菌株。6.2 菌株特性应与A m e s 试验标准相符(见表A1)。突变型菌的某些特性易丢失或变异，遇到下列情况应鉴定菌株的基因型:a.在收到培养菌株后;b.当制备一套新的冷冻保存株或冰冻干燥菌株时;c.当每皿自 发回变数不在正常范围时;d当对标准诱变剂丧失敏感性时;e.使用主平板传代时;f.投入使用前鉴定方法如下:6.2.，增菌培养:在5 m L营养肉汤培养基中接种贮存菌培养物，于3 7 振荡(1 0 0 次/m i n)培养1 0 h或静置培养 1 6 h备用。6.2.2 组氨酸缺陷型的鉴定6.2.2.1 加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸)，不加组氨酸者每1 0 0 m L底层培养基中加。5 m g 分子D 一 生物素0.6 m L;加组氨酸者每1 0 0 m L底层培养基中加L 一 组氨酸(每1 0 0 m L