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【GB 159961995】流行性出血热诊断标准及处理原则 流行性出血热诊断标准及处理原则 前 言 国际上将流行性出血热(EHF)与流行性肾病(Nephopathia epidemica，NE)等统称肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syhndrome，HFRS)。HFRS是由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)中某些病毒引起和由某些啮齿动物携带传播的一类自然疫原性疾病。在我国流行的是EHF，黑线姬鼠和褐家鼠为其主要宿主动物和传染源，其传播主要通过与宿主动物或其排泄物(尿、粪)/分泌物(唾液)接融。EHF起病急，进展快，病死率高，早期诊断对降低病死率有着特殊的重要意义。本标准的附录A，附录B，附录C都是标准的附录；附录D是提示的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：中国预防医学科学院病毒学研究所、中国预防医学科学院流行病学和微生物学研究所、西安医科大学第一附属医院。本标准主要起草人：宋干、杭长寿、陈化新、张成文。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。1 范围 本标准规定了流行性出血热(EHF)的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级、各类医疗、卫生、保健机构工作人员对EHF病人的诊断、预防和治疗。2 诊断原则 依据患者的流行病学史、临床表现及实验室检查结果的综合判断进行诊断，确诊须有血清学或病原学检查结果。3 诊断标准 3.1 流行病学史 发病在EHF疫区及流行季节，或病前两月内有疫区旅居史，或病前两月内有与鼠类或其排泄物(尿、粪)/分泌物(唾液)直接或间接接触史。3.2 临床表现 3.2.1 早期症状和体征：起病急，发冷，发热(38以上)；全身酸痛，乏力，呈衰竭状；头痛，眼眶痛，腰痛(三痛)；面、颈、上胸部充血潮红(三红)，呈酒醉貌；眼睑浮肿、结膜充血，水肿，有点状或片状出血；上腭粘膜呈网状充血，点状出血；腋下皮肤有线状或簇状排列的出血点；束臂试验阳性。3.2.2 病程经过：典型病例有发热期、低血压期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过。前三期可有重叠，并存在有大量五期不全的异型或轻型非典型病例。3.3 实验室检查 3.3.1 血检查：早期白细胞数低或正常，34 病日后明显增多，杆状核细胞增多，出现较多的异型淋巴细胞；血小板明显减少。3.3.2 尿检查：尿蛋白阳性，并迅速加重，伴显微血尿、管型尿。3.3.3 血清特异性IgM抗体阳性，见附录A。3.3.4 恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有 4 倍以上增高，见附录A。3.3.5 从病人血液白细胞或尿沉渣细胞检查到EHF病毒抗原或EHF病毒RNA，见附录D。3.4 病例分类 3.4.1 疑似病例：具备 3.1 及 3.2.1。3.4.2 临床诊断病例：疑似病例加 3.2.2，3.3.1，3.3.2。3.4.3 确诊病例：疑似病例或临床诊断病例加 3.3.3，3.3.4，3.3.5 中的任一项。4 预防原则 采取以防鼠灭鼠及疫苗预防接种为主的综合性措施，抓好人间和鼠间的疫情监测，及时报告疫情，见附录B。4.1 防鼠灭鼠 灭鼠应与防鼠紧密结合。搞好环境卫生及卫生整顿，清除鼠类栖息活动的隐蔽场所，开展以药物杀灭为主，居民区及其周围地区为主的灭鼠措施，在流行高峰期半个月前开展一次突击性灭鼠活动。根据疫区不同类型(家鼠型、姬鼠型、混合型)确定灭鼠重点，一般春季重点在居民区灭鼠，秋季重点在居民区周围及野外灭鼠。4.2 野外作业工地及生活区的预防措施 进入前对施工区及宿营地区进行流行病学特别是疫源地的监测，施工期内做好防鼠灭鼠工作，加强个人防护措施。4.3 个人防护 避免与鼠类及其排泄物/分泌物接触，以减少受感染的危险；对高发病区人群及对其他疫区高危人群接种疫苗。5 治疗原则 抓好“三早一就”(早发现、早休息、早治疗、就近治疗)措施及发热期的治疗，包括抗病毒治疗、预防性治疗(预防低血压、少尿期出现)。通过综合性抢救治疗措施预防/控制低血压休克、肾功能衰竭、大出血(三关)，做好抢救治疗中的护理工作，见附录C。附录A (标准的附录)流行性出血热血清学诊断方法 A1 应用IgM捕获ELISA法检测EHF IgM抗体 A1.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人链多克隆或单克隆抗体捕获待测血清中的IgM，然后加入特异性抗原和酶标特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，加底物显色。显色程度与特异性抗体中的IgM抗体含量呈正相关。以待检血清与特异性抗原和阴性(对照)抗原反应()D值的比值，作为判定IgM抗体反应的标准。A1.2 材料 a)聚苯乙烯塑料板：40 孔或 96 孔板，U型。b)可变微量加样器：20L和 100L各一支。c)抗人IgM(链)：鼠抗人IgM(链)单克隆抗体或羊抗人IgM(链)多克隆抗体。d)抗原：阳性抗原：细胞培养EHFV灭活抗原或基因工程表达抗原；阴性抗原：未接种病毒的细胞培养抗原或无外源基因的相应表达系统抗原。e)抗IgM阴性或阳性对照血清。f)辣根过氧化物酶EHF单克隆抗体标记物(HRPMcAb)。g)包被液：0.1mol pH9.6 的碳酸盐缓冲液(Na2CO3)3.18g，NaHCO35.88g，加蒸馏水至1000mL。h)洗涤液(10)：0.2mol pH7.4 PBST(Na2HPO412H2O 51.6g，NaH2PO42H2O 8.7g，NaCl 76g，Tween20 5mL，溶解至 1000mL)高压后使用，临用前 10 倍稀释。i)稀释液：上述 10 倍稀释的PBST液，含 5牛血清。j)底物液：临用前取柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH5.0)(柠檬酸 10.2g，Na2HPO412H2O 36.8g，加水至 1000mL)。k)终止液：2mol/LH2SO4。A1.3 检测步骤 a)用 0.1 molpH9.6 的碳酸盐缓冲液稀释抗人IgM(链)单克隆抗体(或羊抗人IgM(链)，包被聚苯乙烯塑料板，每孔 100L，4过夜(或 37 2h)。b)弃去包被液，用洗涤液重复洗 3 次，甩干。c)加待检血清：将血清用PBST液稀释 100 倍，分别加入 2 反应孔，每孔 100L(如需设阳性和阴性血清对照亦同此法处理)，37 1h。d)弃去血清，用洗涤液重复洗 5 次，甩干。e)加阳性抗原及阴性抗原：将阳性抗原用稀释液稀释至适当工作浓度，加入其中一反应孔 100L；阴性抗原同样稀释，加入另一反应孔，37水浴孵育 2h或者置 4过夜(效果更优)。f)弃去抗原，用洗涤液重复洗 5 次，甩干。g)加HRPMCAb：将HRpMcAb用稀释液稀释至工作浓度，每孔加入 100L371h。h)弃去标记物，用洗涤液洗 5 次，甩干。i)显色：每孔加入 100L新鲜配制的底物溶液。放在室温暗处显色。j)当观察到阳性抗原(或血清)对照显黄色而阴性抗原(或血清)对照为无色后，每孔加入50L2mol/LH2SO4终止反应。A1.4 结果判断 a)酶标检测仪测定OD值(空白对照调零)，P/N2.1 判为阳性(P：阳性抗原孔OD值；N：阴性抗原孔OD值)。b)目测法：与对照孔比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄色，阴性抗原孔基本无色。A1.5 意义 IgM抗体阳性表示患者新近感染EHF病毒。本法具有高度敏感性和特异性，特别适用于EHF早期特异性诊断。A2 应用间接酶免疫吸附试验(ELISA)检测EHF IgG抗体 A2.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化病毒抗原包被塑料板，与 1100连续稀释的待检血清中的特异性抗体结合，其中血清IgG部分又与后加入的酶标记的抗人IgG结合，通过酶与底物的作用产生可见的颜色反应，根据反应产物的多少，即颜色深浅进行抗体的定量测定。A2.2 材料 a)聚苯乙烯塑料板及可变微量加样器：同A1.2。b)包被阳性抗原和正常对照抗原：细胞培养EHFV抗原(灭活)或初步纯化的基因工程表达抗原为阳性抗原；未接种EHFV的细胞培养正常抗原或无外源基因的相应表达系统的抗原为对照抗原。将阳性抗原和对照抗原作 2 倍稀释，包被聚苯乙烯塑料板，4过夜。以适当稀释的EHF恢复期血清测定抗原，选其中特异性抗原孔OD值最高，而对照抗原孔OD值低于0.05 的抗原稀释度为工作浓度。c)辣根过氧化物酶标记抗人IgG(HRP-IgG)，按上述方法确定其工作浓度。d)阳性对照血清(EHF病人恢复期血清)；待检病人血清(急性期和恢复期病人血清)。e)抗原包被液，洗涤液，血清和结合物稀释液，底物液及终止液均同A1.2。A2.3 检测步骤 A2.3.1 用0.1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被聚苯乙烯塑料板，每孔100L4过夜(或 372h)，同时设阳性和阴性抗原各 2 孔，分别与阳性血清和待检血清反应。A2.3.2 弃去包被液，用洗涤液重复洗 35 次，甩干。A2.3.3 将待检血清从 1100开始作 4 倍稀释，加入各抗原孔，每孔 100L371h。A2.3.4 弃去血清，洗涤液反复洗 5 次，甩干。A2.3.5 加酶结合物，每孔 100L，371.5h，同A2.3.4 法洗 6 次，甩干。A2.3.6 每孔加入 100L新鲜配制的底物溶液，放室温暗处显色。A2.3.7 当阳性抗原与阳性血清对照孔显黄色，而阴性抗原孔为无色(1020min)后，每孔加入 50L2mol/LH2SO4终止反应。A2.4 结果判断 a)目测法：即与阴性抗原孔相比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄色显色反应，判为阳性。b)酶标检测仪测定OD值(空白对照调零)，P/N值大于2.1，判为阳性(P：阳性抗原孔OD/492值；N：阴性抗原孔OD/492 值)。呈阳性反应血清最高稀释度的倒数，即为病人血清IgG抗体滴度。A2.5 意义 恢复期病人血清比急性期血清IgG抗体滴度高，有 4 倍以上升高，可确诊感染，单份血清检测一般表明其曾受过出血热病毒感染，但抗体滴度大于等于 1320时，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近毒感染。A3 应用反向被动血凝抑制试验(RPHI)检测EHF总抗体 A3.1 原理 先将绵羊红血球以戊二醛固定，使其表面阴离子化，再经鞣酸或氯化铬(交联剂)处理，使提纯的特异性抗体吸附到醛化红血球表面致敏，此致敏血球与相应的特异性抗原相遇，即发生特异性抗原抗体反应而使血球凝集，称为反向被动凝集(RPHA)。将含特异性抗体的待检血清与已知抗原先混合，使发生特异性抗原抗体反应而将抗原上的结合位点占据，此时加入抗体致敏血球就不能再与已知抗原起反应，因而不产生血凝，此法称为反向被动血凝抑制(RPHI)。反向被动血凝试验是用来检查抗原的，而反向被动血凝抑制试验则是用来检测抗体的。A3.2 材料 a)微量塑料板：96 孔，U型。b)可调微量加样器。c)高效价兔抗EHF IgG致敏的绵羊红细胞，每支含 3冻干红细胞 1mL，使用前用蒸馏水恢复至 1mL，再用稀释液稀释 10 倍成 0.3。d)EHFV抗原(液体或冻干)：使用前必须测定血凝素效价并稀释成 4 个血凝单位使用。e)稀释液：pH7.2，0.01mol/L PBS，含 1兔血清，用来稀释所有试剂和被检血清。A3.3 检测步骤 A3.3.1 抗原血凝单位测定：采用 96 孔U型板，每孔加入 25L稀释液，取抗原 25L作12，14，18，1256倍比稀释，然后加 0.3致敏红细胞液 25L于微型振荡器上混匀后，放 37水浴 1h，观察结果，以出现十十的抗原稀释度(如 1：64)为 1 个血凝单位，其前 2 个抗原稀释度(116)为 4 个血凝单位。A3.3.2 被检血清稀释及反应：在U型微量反应板，每孔加稀释液 25L，待检血清先作1：10 稀释，取 25L加入第一孔作倍比稀释，然后每孔加入 4 个血凝单位抗原 25L，混匀，放 37水浴(湿盒)中作用 30min，每孔再加入 0.3致敏的红细胞液 25l，同上混匀，再放37湿盒中 2h，观察结果。A3.3.3 设EHF病毒抗原(4 个血凝单位)及稀释液空