GB 15193.3-1994 急性毒性试验.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B 1 5 1 9 3.3 一9 4急性毒性试验A c u t e t o x i c i t y t e s t，主胭内容与适用范围 本标准规定了急性毒性试验的基本技术要求。本标准适用于测定环境有害物质的急性毒性作用。2 原理 经口一次量给予或2 4 h内多次给予受试物后，在短时间内动物所产生的毒性反应，包括致死的和非致死的指标参数，致死剂量通常用半数致死剂量L D s。来表示。3 半数致死里(L D 5 o)的定义 半数致死量(L D 动是使一组受试动物死亡5 0%的剂量，其单位是每公斤体重所摄入受试物质的毫克数，即m g/k g 体重。4 实验步骤41 动物 一般均分别用两种性别的成年小鼠和大鼠。小鼠 体重为1 8 2 2 g，大鼠 体重为1 8 0-J 2 2 0 g。如对受试物的毒性已 有所了解，还应选择对其敏感的动物进行试验，如对黄曲 霉素选择雏鸭，对氰化物选择鸟类。4.2 给予受试物的途径 经 口。4.2.1 动物应隔夜空腹(一般禁食 1 6 h 左右，不限制饮水)。4.2.2 一般采用水或食用植物油，可考虑用梭甲 基纤维素、明胶、淀粉作为混悬液;不能作成混悬液时，可作其他型式的制备(如糊状物等)。必要时可采用二甲基亚枫。但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用未知毒性的溶剂应单设对照组观察。4.2.3 给予受试物的体积，小鼠为。.4 m L/2 0 g 体重，大鼠 为2.0 m L/2 0 0 g 体重。4.2.4 一般一次性给予受试物，如估计受试物的毒性很低或溶解度很低者，可一日内多次给予。每次间隔2-3 h，仍合并作为一次剂量计算。但只须剂量达到1 0 g/k g 体重仍不引起动物死亡，即可停止再进行更多次的给予4.3 方法 可任选下列方法之一:4.3.1 霍恩氏(H o r n)法4.3.1.1 预试验:可根据受试物的 性质和已 知资料，选用下述方法:一般多采用1 0,1 0 0 和1 0 0 0 m g/k g的剂量，各以2-3 只动物预试。根据2 4 h内死亡情况，估计L D s o 的可能范围，确定正式试验的剂量组。一一一一一中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 8-1 0 批准1 9 9 4 一 0 8 门0 实施G B 1 5 1 9 3.3 一9 4也可简单地采用一个剂量，如2 1 5 m g/k g,用5 只动物预试。观察2 h 内动物的中毒表现。如症状严重.估计多数动物可能死亡，即可采用低于2 1 5 m g/k g 的剂量系列 反之症状较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不进行预试43.1.2 动物一般每组用5 只大几 小鼠。4.3，3 常用的剂量系列为:1“:15 X t064一。士 士 2 士 3因 为 剂 量、距 较 1.03.1 6X t 0 t=0，士1，士2,土3 为小，所以结果较为精确。一般试验时，可根据上述剂量系列设计5 个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时容易得出结果。4.3.1.4 正式试验:将动物在实验动物房饲养观察1-2 d，使其适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分组。给予受试物后一般观察9 或1 4 d，若给予4 d 后继续有死亡时，需观察1 4 d，必要时延长到2 8 d。记录死亡数，查表求得L D s o，并记录死亡时间及中毒症状等。4.3.1.5 此法优点是简单易 行，节省动物;缺点是所得L D,。的可信限范围较大，不够精确。但经多年来的实际应用与验证，同一受试物与寇氏 法所得结果极为相近。因此对其测定的结果应认为是可信与有效的。4.3.2 寇氏(K o r h o r)法4.3.2.1 预试验:除另有要求外，一般应在预试中求得动物全死亡或9 0%以上死亡的剂量和动物不死亡或1 0%以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高与最低剂量。4.3.2.24.12.3动物:除另有要求外，一般以设5-1 0 个剂量组，每组6-1 0 只动物为宜剂量:将由预试验得出的最高、最低剂量均换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差按所需要的组数，分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。4.3.2.4 试验结果的计算与统计4.3.2.4.1 列试验数据及其计算表 包括各组剂量(m g/k g)，剂量对数(X)、动物数(n)、动物死亡数(r)、动物死亡百分比(P，以小数表示)，以及统计公式中要求的其他计算数据项目。4.3.2.4.2 L D s o 的计算公式 根据试验条件及试验结果，可分别选用下列三个公式中的一个，求出l o g l.D,o，再查其自 然数，即L D s o(m g/k g).4.12.4.2.1 按本试验设计得出的任何结果，均可用式(1):l o g L D s o=Y,专(X;+龙+,)(只+1 一P).(1)式中:X 与X:+,及只十，与P;分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。4.12.4.2.2 按本试验设计且各组间剂量对数等距时，可用式(2):l o g L D s o=X K+只十 户 ，“4 一(2)式中:X K-最高剂量对数，其他同式(1)e4.12-4.2.3 若试验条件同4.3.2.4.2.2 且最高，最低剂量组动物死亡百分比 分别为l o o(全死)和。G B 1 5 1 9 3.3 一 9 4(全不死时)，则可用便于计算的式(3).l o g L D,。一X K一d(习P 一。.5)，(3)式中4.3.4.3艺P 一 各 组 动 物 死 亡 百 分 比 之 和，其 他 同 式(2).2.4.3 标准误与 9 5 0 0 可信限2.4.3.1 l o g L D,。的标准误(S):S l o g L D,=d艺尸(1 一尸 ).。.。，.，一(4)4.3.2.4.3.2 9 5%可信限(X)X=l o g-(l o g L D,。士1.9 6 S l o g L D,o)”，”，(5)此法易于了解，计算简便，可信限不大，结果可靠，特别是在试验前对受试物的急性毒性程度了解不多时，尤为适用。4.3.3 机率单位对数图解法4.3.3.1 预试验:以每组2 -3 只动物找出全死和全不死的剂量。4.13.2 一般每组不少于1 0 只大、小鼠，各组动物数量不一定要求相等。4.3.3.3 剂量及分组:一般在预试得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多的组。此法不要求剂量组间呈等比关系，但等比可使各点距离相等，有利于作图。4.3-3.4 作图计算4.3-3-4.1 将各组按剂量及死亡百分率，在对数概率纸上作图。除死亡百分率为0%及1 0 0%者外，也可将剂量化成对数，并将百分率查概率单位表得其相应的概率单位作点于普通算术格纸上，。%及1 0 0%死亡率在理论上不存在，为计算需要:。%改 为 0.2 5 X 1 0 0 Y，1 0 0%N改 为(N 一 0.2 5)NX 1 0 0%N为该组动物数，相当于。写及1 0 0%的作业用概率单位。4.13.4.2 划出直线，以透明尺目 测，并照顾概率。4.3.3.5 计算标准误S E=2 S/1 2 丙7.(6)式中:N-概率单位3.5-6.5 之间(反应百分率为6.7-9 3.7 之间)各组动物数之和;S E 标准误;2 S-L D a;与L D,之差，即2 S-L D s,-L D,6(或E D e,-E D,6),相当于I _ D R。及L D,6 的剂量均可从所作直线上找到。也可用普通方格纸作图，查表将剂量换算成对数值，将死亡率换算成概率单位，方格纸横坐标为剂量对数，纵坐标为概率单位，根据剂量对数及概率单位作点连成线，由概率单位5 处作一水平线与直线相交，由相交点向横坐标作一垂直线，在横坐标上的G B 1 5 1 9 3.3 一 9 4相交点即为剂量对数值，求反对数致死量(L D,a)值。中毒反应观察给予受试物后，即应观察并记录实验动物的中毒表现和死亡情况。观察记录应尽量准确、具体、完包括出现的程度与时间。对死亡动物可作大体解剖。结果评价Jq，亡d车整东根据L D s 0 数值，判定受试物的毒性分级。由中毒症状初步提示毒作用特征。5 急性联合毒性试验5.1 原理 两种或两种以上的受试物同时存在时，可能发生作用之间的拮抗，相加或协同三种不同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来确定这三种不同的作用。5.2 步骤5.2.1 分别测定单个受试物的L D,O，方法同前。5.2.2 按各受试物的L D,O 值的比 例配制等毒性的混合受试物。5.2.3 测定混合物的L D,O(H o r n氏法)，用其他L D s o 测定方法时，可以按各个受试物的L D”值的二分之一之和作为中组，然后按等比级数向上、下推算几组，与单个受试物L D s o 测定的设计相同，如估计是相加作用，可向上、下各推算两组，如可能为协同作用，则可向下多设几组;如可能为拮抗作用，则可向上多设几组。5.3 计算5.3，混合物中各个受试物是以等毒比例混合的，因此求出的L D s o 乘以各受试物的比例，即可求得各受试物的剂量。5.3.2式中:5.3.3用式(7)计算混合物的预期L D,。值的比值，按比值判定作用的方式。混合物的预期L D,。值一 妥 贾 丽 下 丽工 石 石 i ft!1R#1 A O J L D sa+b受试物 B的L D,。值+受试物N的L D s。值。二。二。.。二。(7)a,b.n-A,B.N各受试物在混合物中所占的质量比例，a+b+十n=1判定受试物联合作用方式的比值采用S m i t h.H.F的规定，即小于0.4 为有拮抗作用，0.4-2.7 0 为有相加作用，大于2.7 为有协同作用。G B 1 5 1 9 3.3-9 4 附录A粗恩氏(H o r n)法L D 5 o 值计算用表(剂皿递增法测定L D 5。计算用表)(补充件)兰表A I 用于每组5 只动物，其剂量递增公比为扩 面，意即I O X 1 0=2 1.5,2 1.5 X Y N O=4 6.4，余此类推。此剂量系列排列如下:X1 0,t=0，士1，士2，士3.，|引训别0-U011.飞.Q自乙表 A1|冲!配 ，1 X!户.1.ee 翻 n 1 X十卜|1组 1组 2组 3组 4或组 1组 3组 2组 4剂量 1=0.4 6 4剂量 2=1.0 0剂量 3=2.1 5剂量 4=4.6 4剂量 1 二1.0 0剂量2=2.巧剂量3=4.6 4剂量 4=1 0.。剂量 1=2.1 5剂量 2=4.6 4剂量 3=1 0.0剂量 4 二2 1.5D-泛c卜汪司1洲，川乳乳孔L-976976576仁J仁忆，.-可信限可信限可信限0 03 51.3 7-2.9 11.2 6-2.3 32.9 5 -6.2 66.3 6-1 3.52.7 1-5.0 15.8 4-1 0.92.6 5-6.9 85.7 0-1 5.02.2 7 -5.9 94.8 9-1 2.92.0 5-4.8 94.4 1 一 1 0.5竺娜姗洲卿渊冰洲娜冰2711.2 3-3.2 41.0 5-2.7 80.9 5 1-2.2 7D-c尸司洲汉扣尸L-，曰、JI八乙11:，:一0.9 2 6 -1.7 11.0 1 -2.9 12.0 0 3.6 94.3 0-7.9 42.1 7 6.2 84.6 7-1 3.5n叹U:.:0.8 6 2 2.5 01.8 6 -5.3 84.0 0-1 3.50.7 7 52.0 51.6 9 -4.4 13.6 0 -9.5 0:.:0.7 4 1-1.5 7:1.6 0 3.9 91.5 9-4.6 23.4 4 -7.3 00.7 4 0-2.1 43.4 3-9.9 51.0 31.9 61.6 21.3 31.9 61.6 20.6 6 5-1.7 52.3 31.4 3-3.7 83.0 8-8.1 41.2 2 3.1 44.2 22.6 3 6.7 65.6 6-1 4.61.0 7