GB 15193.10-1994 非程序性DNA合成试验.pdf

中华 人 民 共和 国 国 家标 准G B 1 5 1 9 3-1 0 一 9 4非 程 序 性 D N A合 成 试 验U n s c h e d u l e d D N A s y n t h e s i s t e s t1 主题内容与适用范围 本标准规定了非程序性D N A合成试验的基本技术要求。本标准适用于预测环境有害物质的致癌性/诱变性，用这种短期筛选方法可以 检测出一些短期体外试验法所不能检出的诱变剂/致癌剂。2 引用标准 G B 1 5 工 9 3.魂 鼠 伤寒沙门氏 菌/哺乳动物微粒体酶 试验3 原理 正常情况下，于细胞有丝分裂周期中，仅S 期是D N A合成期。当D N A受损伤时，损伤修复的D N A合成主要在其他细胞周期，称程序外D N A合成，即U D S,因此发现U D S 增高，即表明D N A发生过损伤 在体外培养细胞中，用U D S 的测量来显示D N A修复合成的主要关键在于如何鉴别很高水平的半保留D N A复制和水平较低(充其量只有半保留D N A复制的5 0 0)的U D S,这可以用同步培养 将细胞阻断于G，期并用药物 常用经基脉)抑制残留的半保留D N A复制后显示。同步培养可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培养基(A D M)使D N A合成的始动受阻而使细胞同步于G,期.在这些半保留D N A合成明显抑制和阻断了的细胞中，U D S 即可用 H-胸腺喃吮核昔的掺入增加显示。它可用放射自显影或液体闪烁计数法进行测蚤.3 试荆的配制和细胞培养器皿的准备3.1 试剂 全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双燕水。3.1.1 细胞增殖用培养基,E a g l e 氏 最低要求培养基(Mi n i m a l E s s e n t i a l M e d i u m,简称E M E M)8 5 份，小牛血清 1 5 份，加入青霉素、链霉素贮存液 1 份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为 1 0 0 单位及1 0 0 p g/m L.E M E M培养基可 选用各种商品 供应之粉 末培养基 按生 产厂 商提供资料配制并除菌a 4 冰箱贮存。3.1.2 同步用培养基:不含精氨酸之E a g l e 氏M E M培养基(A D M)9 8 份，小牛血清2 份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。3.1.3 H a n k s 平衡盐溶液(H B S S)贮液A:将氯化钠1 6 0 g,氯化钾8 g，硫酸镁(Mg S O,7 H 0)2 g 及氯化镁(M g c l,，6 H,0)2 g 溶于8 0 0 m L 双蒸水(5 0 -6 0 0C)中。另取无水氯化钙2.8 g 溶于1 0 0 a l l 双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水至1 0 0 0 m l-，加入三氯甲 烷2 m L，保存于4 中。-如 间 一一一 一一一目 一一一，一一-.一中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 8-1 0 批准1 9 9 4 一 0 8 一 1 0 实施G B 1 5 1 9 3 1 0 一 9 4 贮液 B:将磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H 2 0)3.0 4 9(或 N a 2 H P 0,2 H 2 0 1.2 g),磷酸二氢钾(K H I P 0,2 H 2 0)1.2 g(或K H 2 P O a 0.9 5 g),葡萄糖2 0 g 溶解于8 0 0 m L双蒸水中，加入1 0 0 m L O.4 环酚红溶液(取酚红1 g,溶于3 m l,l m o l/L氢氧化钠中，待完全溶解后，加入双蒸水中至2 5 0 m L)，加水至1 0 0 0 m L，加入三氯甲烷 2 m L，保存于4 中。贮液C:1.4%碳酸氢钠以双蒸水配制。应用液的配制:取A液1 份，B液1 份，水1 8 份，混合后分装于玻璃容器内，高压灭菌,4 保存。用前加人1.4%碳酸氢钠，将p H调整至7.2-7.4 03.1.4 磷酸缓冲液(无钙、镁的D u l b e c c o 氏 磷酸缓冲盐液)(p H 7.4)取氯化钠8.0 0 g,磷酸二氢钾0.2 0 g,氯化钾。2 0 g,磷 酸氢二 钠(N a 2 H P 0,1 2 H,0)2.9 9 g 溶于1 0 0 0 m L双燕水中。31.5 0.0 2%乙二胺四乙酸二钠或四钠(E D T A)溶液。取E D T A O.2 g 溶于无钙、镁之磷酸缓冲液中，使成1 0 0 0 m L。高压灭菌后使用。3.1.6 抗菌素贮存液 取 临 床 注 射 用 青 霉 素 G 1 0 0 万 草 位 及 链 霉 素1 g 之 粉 针，在 无 菌 操 作 下 溶 于1 0 0 m L 之 灭 菌 蒸 馏 水中，使青霉素及 链霉素 在溶液中 之 浓度 分别为1 万 单位及1 0 0 0 0 p g/m L，使用时每1 0 0 m L 培养基中 加入抗菌素贮存液1 m L.3.1.7 大鼠 肝微粒体S-9 组分的制备:按G B 1 5 1 9 3.4 执行。S-9 混合液可按以下方式配制:将磷酸氢二钠(N a 2 H P 0,1 2 H 刀)8 6.8 m g,磷酸二氢钾7.0 m g,氯化镁(M g C h 6 H,O)8.1 m g,6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5.4 m g,辅酶I(C O I)(纯度9 0%)4 m g 溶于A D M中，加人1 m o t f L N-2-轻乙基呢嗦-N-2 一 乙磺酸(H E P E S)溶液0.2 m L及大鼠肝S-9 组分。.8-4 m L 或2 0 m L，并用碳酸氢钠溶液调整p H至7.2-7-4.3.1.8 显影液及定影液(放射自 显影用)3.1.8.1 K o d a k D-1 7 0 显影液 贮液:无水亚 硫酸钠2 5 g,澳化钾I g，水加至2 0 0 m L。使用时用 水稀释至1 0 0 0 m l-,溶入A m i t o l(2 一 氨基酚盐酸盐)4.5 9。3.1-8.2 K o d a k D-1 9 6 显影液 水(5 0 05 0 0 m L，顺次溶人米吐尔(硫酸对甲氨基苯酚)2 g，无水亚硫酸钠7 2 g，对苯二酚8.8 g，无水碳酸钠4 8 g,嗅化钾4 g，加水至全量1 0 0 0 m L oI，.83 停显液 9 8%冰乙酸1 5 m L，加水至1 0 0 0 m L e3.1.&4 K o d a k F-5 定影液 水(5 0 0C)1 0 0 m L，依次溶人海波2 4 0 g，无水亚硫酸钠1 5 g,2 8%乙酸4 8 m L,硼酸(结晶)7.5 g，钾矾1 5 g，加水至1 0 0 0 m L o3.1.9 0.2 5 m o l/L及 0.5 m o l/L高氯酸:7 0%高氯酸:(售品)8.5 7 m L,加水至1 0 0 m L为1 m o t/L.3.11 0 闪烁液:称取2,5 一 二苯基91哇(P P O)5 g,1,4 一 双一 5 一 苯基P t 哇基一 2 -苯(P O P O P)3 0 0 m g 溶于甲 苯中，使 成1 0 0 0 m L,应用一次性细胞培养用器皿及微孔滤膜，可避免繁琐的洗涤工作，并可提高实验质量。玻璃类:在自 来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5 m i n,稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自 来水冲洗干净。干后浸于清洁液内过夜。取出后用自 来水反复冲洗1 2 次。再用蒸馏水冲洗2 次，于蒸馏水浸泡2 4 h。取出后用蒸馏水再冲洗2 次，烘干。所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端 管内塞人棉花栓后用纸包裹。橡皮类:自 来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸。若为新购置的，则用4%氢氧化钠煮沸1 0 m i n，再 用4%盐酸煮沸1 0 m i n。自 来水流水冲洗2 h 以上。再于蒸馏水中煮沸2 次，用蒸馏水冲洗后，浸泡于蒸G B 1 5 1 9 3 1 0 一 9 4馏水中2 4 h，干燥后，用玻璃纸包装。置于容器内。6 号玻璃滤器(除菌用):新购置的浸人含少量亚硝酸钠的热硫酸内2 4 h,蒸馏水抽滤后，用氢氧化钠溶液抽滤至中 性，再用双蒸水抽滤2 次，烘干后配上橡皮塞后包扎。滤器使用后立即用蒸馏水抽滤一次，随后用1%亚硝酸钠硫酸溶液(硫酸溶液浓度0.5 m o l/L)抽滤后，浸于该硫酸溶液内(注意必须使滤板的两侧都浸于酸内)。清水冲洗后，用蒸馏水抽滤3 次，干燥后，配塞包扎。灭菌:对不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌，温度升至1 4 0 后，保持2 h a橡皮类及带橡皮塞之玻具应用高压灭菌1 2 0 0C 3 0 m i n,溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用 1 1 5 C 1 0 m i n,4 步骤本，细 胞的 传代、维持和贮存 用于化学致癌物在体外培养细胞中诱发U D S 的实验研究的哺乳类细胞的种类很多。人类细胞的U D S 反应大于啮齿类细胞 在化学致癌性检测试验中很多人使用人类细胞。这有一个可取的优点，即某一化学物质对人类危害作评价时，可减轻因种属差异而导致推论错误的风险。使用最多的人类细胞为成纤维细胞，外周血淋巴细胞，单核细胞和H e l a 细胞等。使用人羊膜细胞F L株，是一种上皮细胞系，且该羊膜细胞富含有可诱导的药物代谢酶系。生长成单层的细胞，除去培养基。用H a n k s 平衡盐液(H B S S)洗涤后，用0.0 2%E D T A或。1%胰酶溶液(于无C a z+M g z+之磷酸缓冲液中)于3 7 下处理数分钟使细胞退缩，细胞间间隙增加。再用H B S S 洗涤1 次，加入适量培养基，反复吹吸，使细胞自 玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液一滴，加于血球计数池中，计数四大格中的细胞数，计算出悬液中之细胞浓度(四大格的细胞数/4 X1 0 即为每毫升所含细胞数)。将细胞悬液用生长用培养基稀释至。.5-1 X 1 0 5 个/m L。将上述细胞悬液接种于培养瓶中(3 0 m L培养瓶可接种3 m L,1 0 0 m L的可接种1 0 m L)。每次接种3 份，长成融合单层后取其中一瓶再按以上方法传代接种3 瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供实验所用，这样可保证细胞在实验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供实验所用。将细胞增殖至所需数量后，按上法制成细胞悬液(于生长用培养基中)。细胞浓度为1 1.5 X 1 0 个/m L。在冰浴中，逐滴加人为细胞悬液总量1 0 线的灭菌二甲亚矾。然后将细胞悬液分装于洁净干燥之灭菌安瓶或细胞冻存专用塑料小管中，每份1 m L。封口 后，置于4 中2 -3 h,然后移至普通冰箱之冰格内4 -5 h，再移入一3 0 -2 0 之低温冰箱内过夜。次日 晨将安瓶移入生物用液氮贮存器内。需用时，将安散或小管自液氮中取出，投入 3 7 之水浴内使其迅速解冻。离心(2 0 0 0 r/m i n)后将安瓶或小管锯(打)开，除去含有二甲亚矾的培养基，加入适量之生长用培养基，并调整细胞浓度至1 0-1 5 X 1 0 个/m L。分种于细胞培养瓶中，3 7 培养1 d 后，换培养基一次，将无活力之细胞除去，待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。4.2 U D S 的放射自显影显示法 将细胞增殖至所需数量后，按上述方法制成单细胞悬液，细胞悬于生长用培养基(E M E M8 5 小牛血清1 5)中。浓度为。5 1 X1 0，个/m L。将上述细胞悬液接种于置有小盖片(1 8 m mX6 m m)之培养瓶 中，3 7 培养1-3 d，使细胞在盖片上生长至适当密度。培养瓶接种数目 根据检品的数目、所选剂量级别 而定。每一剂量作2-3 个样片，并另备4 -6 个样本供溶剂对照和已知致痛物的阳性对照用。细胞在增殖培养后，按以同步培养用培养基(A D M补以1%小牛血清)作同步培养3-4 d。在实验前一日 下午，加 入溶于A D M之羚基脾(H U)溶液，使H U在培养基中之终浓度为 1 0 m m