DB33T 752-2009 植物种苗组培快繁技术规程.pdf

ICS 65.020.20 DB33B05 备案号：浙江省地方标准DB33/T 7522009植物种苗组培快繁技术规程 Technical regulations for plant micropropagation 2009-08-10 发布 2009-09-10 实施浙江省质量技术监督局 发布食品伙伴网http:/食品伙伴网http:/DB33/T 7522009 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 术语和定义.1 3 组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂.1 4 组培苗生产流程.2 5 培养容器和接种器械的清洗.2 6 培养基的配制.3 7 消毒灭菌操作.4 8 培养材料和外植体灭菌.4 9 接种操作.5 10 培养室操作.6 11 组培苗移栽和组培穴盘苗生产.7 12 质量标准.8 13 包装、标志、运输.8 附 录 A（资料性附录）常用植物组培术语和定义.9 附 录 B（资料性附录）植物组培苗生产流程图.12 附 录 C（资料性附录）组培工厂设计、所需面积及设计要求.13 附 录 D（资料性附录）组培工厂所需的仪器设备.14 附 录 E（资料性附录）组培工厂所需的玻璃器皿及器材.16 附 录 F（资料性附录）常用基本培养基成分表.18 附 录 G（资料性附录）植物组培常用化学试剂、药品一览表.20 附 录 H（资料性附录）MS培养基母液配配制表.23 附 录 I（资料性附录）常用植物生长物质的母液配制.24 食品伙伴网http:/DB33/T 7522009 II 前 言 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G、附录H、附录I均为资料性附录。本标准由浙江省农业厅提出并归口。本标准起草单位：浙江省农业科学院。本标准主要起草人：陈剑平、徐刚、K.B.Kumar、汪一婷、吕永平、牟豪杰。食品伙伴网http:/DB33/T 7522009 1 植物种苗组培快繁技术规程 1 范围 本标准规定了植物种苗的组培快繁的术语和定义、组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂、组培苗生产流程、培养容器和接种器械的清洗、培养基的配制、消毒灭菌、培养材料和外植体灭菌、接种操作、培养室操作、组培苗移栽和穴盘苗生产、质量标准及包装、标志、运输等内容。本标准适用于植物种苗的组培快繁技术规程管理的全过程。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。常用植物组培术语和定义参见附录A。2.1 组培苗 plantlet 利用植物器官等作为外植体，采用植物组织培养技术生产的种苗。2.2 琼脂苗 in agar plantlet 利用植物器官等作为外植体，采用植物组织培养技术生产的种苗。2.3 无琼脂苗 ex agar plantlet 从培养容器中取出并洗去琼脂后的组培生根苗。2.4 组培穴盘苗 plug plant 移栽在穴盘中培育的组培生根苗。3 组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂 3.1 设计要求 3.1.1 组培工厂应建在排水设施良好，常年主风向的上风区。应远离各种污染源（如粉尘大的工厂、微生物工厂和繁忙交通干道），周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。3.1.2 组培工厂新建建筑地基应高出地面 30 cm 以上，楼顶不应有渗漏；若建两层或三层，宜安装简单载物电梯；准备室、洗涤室、培养基配制室、灭菌室宜安排在楼下，接种室、培养室应防潮、隔热保温，宜安排在二楼、三楼。3.1.3 组培工厂各分区要布局合理，应根据生产工艺流程（参见附录 B 植物组培苗生产流程图），把各部分安排成一条连续、有序和通畅的生产流水线。3.1.4 利用办公室、仓库等旧房进行改造的组培工厂，应合理安排，做到杜绝污染，方便工作，节省能源，使用安全。3.1.5 组培工厂设计包括组培车间：洗涤室、培养瓶晾干室、药品室（称量室）、培养基配制室、灭菌室、培养基储存室、更衣室、接种室、培养室、出苗室和贮物室；办公生活区：办公室、工作人员室和其它生活空间等；大棚温室：母本圃、组培苗驯化区、组培苗移栽圃和辅助用房等。3.1.6 不同规模组培工厂设计、所需面积及设计要求参见附录 C。3.2 仪器设备及化学试剂 食品伙伴网http:/DB33/T 7522009 2 3.2.1 植物组培所需的仪器设备包括灭菌设备、培养设备和培养容器、实验设备、办公用品和消防灭火设备等。不同规模组培工厂所需的仪器设备参见附录 D。3.2.2 组培所需的玻璃器皿及器材包括盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。不同规模组培工厂所需的玻璃器皿及器材参见附录 E。3.2.3 常用化学试剂包括组培苗生产所用基本培养基所需的无机盐类和有机物类。常用基本培养基成分参见附录 F。组培中常用的无机盐类、有机物类、植物生长物质、消毒剂、洗涤剂等参见附录 G。4 组培苗生产流程 4.1 生产流程图 植物组培苗生产流程参见附录B。4.2 新品种引进、母本圃种植 将引进的新品种植株种植在温室内，加强肥水管理，确保植株健壮，防治病虫害，减少植株表面附带的微生物和害虫。4.3 材料选择 从具有品种典型性状的健康植株上选择芽、茎或叶等植物材料作为外植体。4.4 外植体灭菌 参见8.3 外植体灭菌的方法将取得的外植体进行表面灭菌。4.5 初代培养 在无菌滤纸上将表面灭菌处理后的外植体切割成所需大小，一般约为0.5 cm0.5 cm0.5 cm大小，接入初代培养基中进行培养。外植体初代培养20 d40 d后，一般可诱导出幼芽。4.6 增殖培养 将初代培养诱导形成的幼芽或丛生芽，转接到增殖培养基中进行培养。增殖培养周期根据培养材料及组培苗生长情况而定，一般培养周期为30 d60 d；增殖培养代数控制在16代24代以内，繁殖系数控制在2.54.0。4.7 壮苗培养 将增殖的丛生芽接种到壮苗培养基中，培养20 d30 d后幼苗株高可生长达2 cm5 cm。4.8 生根培养 从壮苗培养的幼苗中切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展、适于生根的无根苗，接种在生根培养基中进行培养，培养20 d30 d后幼苗基部长出数根新根。4.9 组培苗炼苗移栽 组培苗炼苗3 d7 d后移入含蛭石、泥炭、珍珠岩等基质或混合基质的穴盘中。4.10 穴盘苗生产管理 穴盘苗在温室大棚中进行光、温、水、肥等管理，培育2个月3个月，穴盘苗可长至10 cm15 cm高。4.11 出苗、包装、运输 按本标准第13章 包装、标志、运输的方法将琼脂苗、无琼脂苗和组培穴盘苗经包装后出售。5 培养容器和接种器械的清洗 5.1 培养容器的清洗 5.1.1 浸泡：新的培养容器（培养瓶、培养皿和试管等）直接放入洗洁精或洗衣粉溶液中浸泡；用过的培养容器须先倒掉瓶中的培养基后再浸泡；污染的培养容器应先按 7.1 的要求进行高压灭菌，然后倒掉瓶内污染物再浸泡；浸泡时间不应少于 6 小时，一般为过夜。5.1.2 洗刷：用瓶刷洗刷瓶内残留的培养基和瓶外的灰尘。5.1.3 冲洗：将培养容器用自来水冲洗 3 遍5 遍。食品伙伴网http:/DB33/T 7522009 3 5.1.4 晾干：把冲洗干净的培养容器倒放在培养容器专用框中晾干。5.1.5 清洁标准：晾干的培养容器内外壁无明显的斑点、污迹。5.2 接种器械的洗刷 5.2.1 清理：清除接种器械（镊子、解剖刀柄、不锈钢碟等）上残留的培养基和培养材料。5.2.2 清洗：在洗洁精溶液中浸泡数分钟，用钢丝球洗刷后用清水冲洗 3 遍5 遍。5.2.3 灭菌：用棉布或纸等包好接种器械，按 7.1 进行高压灭菌。5.2.4 玻璃器皿应小心轻放，避免打碎划破手。移取烫手的器械时应戴隔热手套（如棉手套或石棉防火手套）。若发生意外参见相关实验室安全规程处理。6 培养基的配制 6.1 培养基选择 根据培养材料生长发育特性选择合适的基本培养基种类和激素配比（常见基本培养基成分参见附录F）。6.2 化学试剂的选择和保存 6.2.1 应符合附录 G 所要求的试剂级别。6.2.2 应标签完整，并在有效期内使用。6.2.3 每瓶试剂在使用前目测应无异物异色。6.2.4 应严格按规定的温度存放。6.3 基本培养基母液的配制和保存 6.3.1 制作培养基前需先配制基本培养基母液，MS 基本培养基母液配制比例参见附录 H，其它基本培养基母液配制比例可参考本方法。6.3.2 母液配制应用去离子水。6.3.3 母液保存要求：母液保存应置于 4 左右的冰箱内。母液保存期应不超过 15 天。6.3.4 母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。6.4 植物生长物质的母液配制 6.4.1 植物生长物质的母液配制浓度 0.1 mg/mL1.0 mg/mL，植物生长物质的母液配制方法参见附录I。6.4.2 植物生长物质的母液保存要求：母液配制好后贴好标签，按规定要求保存，保存期应不超过 2个月。6.5 培养基制作 6.5.1 准备：根据培养基成分准备好去离子水、琼脂、蔗糖和各类母液等。6.5.2 琼脂融化：加去离子水 700 mL（按所需容量的 70%左右），再加入琼脂 5 g9 g，加热搅拌使琼脂融化。6.5.3 糖溶解：琼脂融化后，加入蔗糖 30 g，稍加热使糖溶解。6.5.4 加母液：糖溶解后，按附录 F 吸取母液，即依次加入 A 大量元素 50 mL/L、B 铁盐 10 mL/L、C 微量元素 5 mL/L、D 有机成分 5 mL/L、E 有机成分 10 mL/L；再根据要求加入激素（不耐高温的激素，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入）若干，并充分搅拌。6.5.5 定容：搅拌均匀后，加去离子水至 1 升。6.5.6 pH 值测定：充分搅拌后，用 pH 计或 pH 试纸测 pH 值，用 0.1 mol/L 的 HCl 或 0.1 mol/L 的 NaOH调节 pH 至要求值，一般为 5.8。6.5.7 分装：根据不同需要定量分装，如 250 mL 的培养瓶，每升分装 25 瓶30 瓶，每瓶分装约 33mL40 mL。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。6.5.8 封口：盖好瓶盖，或用封口膜封口，扎绳需紧。食品伙伴网http:/DB33/T 7522009 4 6.5.9 灭菌：分装后应按照 7.1 的要求，在 10 h 内进行高压灭菌。6.5.10 冷却：灭菌后的培养基应冷却，待完全凝固后再用。6.5.11 贮存：灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后分门别类储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量，宜将配制好的培养基放置 5 天左右再用，且贮存时间不应超过一个月。注：6.5.16.5.11为配制1升 MS培养基的方法，配制其它不同容量MS培养基的方法可参考本方法。7 消毒灭菌操作 7.1 湿热灭菌 7.1.1 组培中主要采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌，高压灭菌器适用于培养基（不耐高温的成分除外）、无菌水、玻璃器皿、金属器械等，以及污染瓶的灭菌处理。7.1.2 应严格按使用说明书操作各种类型的高压灭菌器。7.1.3 灭菌要求：一般 1.1 kg/cm21.2 kg/cm2下，121 灭菌 20 min30 min。7.1.4 已灭菌的培养瓶或物品不得与未灭菌培养瓶或物品混放；合格的灭菌培养瓶或物品，应注明灭菌日期，合格标志。7.2 干热灭菌 7.2.1 玻璃器皿及耐热器械应采用干热灭菌。7.2.2 干热灭菌利用烘箱加热到 160 180 的温度来杀死微生物，通常 170 持续 90 min 进行灭菌。7.3 过滤灭菌 7.3.1 不耐热的物质需采用过滤灭菌，一些植物激素（如赤霉素、玉米素、脱落酸等）和一些抗生素类通常采用过滤灭菌方法。7.3.2 过滤灭菌采用滤膜网孔直径为 0.45 m 以下的微孔过滤灭菌器。7.4 灼烧灭菌 7.4.1 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。7.4.2 灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或用酒精灯灼烧灭菌。7.5 擦拭、喷雾灭菌 7.5.1 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植