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I C S 1 1.2 2 0B 4 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 7 0 一 2 0 0 2马流产沙门氏菌病诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r e q u i n e a b o r t u s s a l mo n e l l o s i s2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发 布N Y/T 5 7 0-2 0 0 2前言 马流产沙门氏菌病(e q u i n e a b o r t u s s a l m o n e l l o s i s)是由沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌等引起的一种以孕马流产为主要特征的马属动物传染病，又名马副伤寒或马沙门氏菌性流产。幼驹感染后表现腹泻、关节肿大、支气管炎或败血症，公马、公驴表现辜丸炎、移甲肿，在成年马中偶尔发生急性败血性胃肠炎 马流产沙门氏菌病在世界动物卫生组织 Wo r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l H e a l t h(英),O f f i c e I n-t e r n a t i o n a l d e s E p i z o o t i e s(法),O I E 编著的 哺乳动物、禽和蜜蜂A类和I3 类疾病诊断试验和疫苗标准手册 中虽未单列本病，但在沙门氏菌病一章中规定了诊断试验方法。本标准与 卜 述手册中沙门氏菌病的主要诊断技术病原鉴定和血清学试验基本一致 本标准的附录A为资料性附录。本标准由 农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国人民解放军军需大学。本标准主要起草人:王世若、王兴龙、沈广、梁焕春、江文正。lv v/T 5 7 0-2 0 0 2马流产沙门氏菌病诊断技术1 范 围本标准规定了马流产沙门氏菌病的病原学检杳及血清学检查的技术要求。本标准适用于马属动物马流产沙门氏菌病的诊断及检疫2 规范性引用文件 FA文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是9 1 1 1 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修汀版均不适用于本标准 然而。鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这此文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用千木标准。GB 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试刊3 细菌学检查3 门器材 恒温箱、高压灭菌器、显微镜、灭菌试管,5 ml灭菌注射器、煮沸消毒器、外科剪、棉棒、镊、载玻片、铂金耳、酒精灯等I2 培养基及试荆3.2-1 四 硫磺酸钠煌绿增菌液(T T B)，见G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中4.1 4,1.1 53.2.2 沙门 志贺(S S)琼脂，见G B 4 7 8 9.2 8 1 9 9 4 中4.2 2 03.2.3 尿素琼脂，见G B 4 7 8 9.2 8 一1 9 9 4 中3.1 53.2.4 糖发酵管，见G B 4 7 8 9.2 8一 1 9 9 4中3.23.2.5 蛋自豚水及靛基质试剂，见G B 4 7 8 9.2 8 1 9 9 4 中3.1 33.2.6 缓冲葡萄糖蛋白陈水、甲基红(M l z)试剂及维培(V P)试剂，见G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中3.43.2.7 份糖铁琼脂(T S I).见G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中4.2 6,4.2 73.2.8 节兰氏染色液，见G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中2.2 03.2.9 沙门氏菌属因子血清(2 6 种，分型用)3.2.1 0 I L 明系小鼠，清洁级，体重1 7 g-2 0 g o13 检验程序 马流产沙门氏菌检验流程见附录A(资料性附录)。13 门病料标本采集13 门.，孕马流产胎儿，用外科剪无菌打开腹腔，用注射器吸取腹水或胃内容物注入灭菌试管中;或用外科剪取肝、脾、肾、心等置培养皿中I11.2 流产母马胎衣，用灭菌棉棒蘸取勃液或刮取胎衣病变组织置十试管中。I11.3 公畜精液应于采精后，立即用注射器等吸取，注人试管中。I11.4 幼驹关节病变局部用碘酒及酒精消毒后，以注射器吸取关1 5 液或肿胀部渗出液，注人试管中待检3-3.2 显微镜检查3.3-2.1 操作方法 将病料标本涂于载玻片 卜。革竺氏染色，镜检。N Y/T 5 7 0一 2 0 0 2I12.2 结果观察 沙门氏菌为两端钝圆的中等大杆菌，有时近似球杆形，单独散在.着色良好，偶见菌体两端着色较深，革兰氏阴性I13 分离培养I13 门操作方法 用铂余耳钓取病料标本。接种于 T T B增菌液中做增菌培养，同时接种于普通琼脂、S S琼脂做分离培养，于3 7(恒温箱中孵育1 8 h 一2 4 h aI13-2 培养特性观察 见到下述培养特性时，符合沙门氏菌特性。I13.2 门T T 13 增菌液 生 长良好，均匀混浊，管底有猫稠沉淀物II12.2 普通琼脂 正圆形、表面光滑、微隆起、闪光、半透明、边缘整齐的中等大菌落(直径2 mm-4 m m)II12.3 s s琼脂 i 1.圆形、淡桔红色、“之 透明中等大菌落，产生硫化氢(H,S、的菌株，有时使菌落中心带黑色13.4 生化特性鉴定33.4.1 操作方法33.4 门.1 初筛培养 用铂金1 选取 I_ 述o r 疑菌落，先接种于 一F S l 培养纂的斜面 1.,再穿刺接种于底层内，于 3 7 C孵育1 8 1-2 4 1做初筛培养，如果 F 层培养基变黄色、混浊.1 产生气体，I 层斜而颜色不变仍为红色 有些菌株产 I 硫化城时 则使培养墓呈黑色。以卜 符合沙门氏菌的特征33.4.1.2 鉴别培养 从符合沙门氏菌特征的 卜 述斜面培养物 于 钓菌，分别接种于生化试验月 培养琴,3 T(恒温箱孵育2 4h 6】、33.4.2 生化特性 生化特性见衣 1。表 1 细菌生化特性 一，一 萄细闲艺称1 秘 一 TL麦芽糖t t露醇箕R醇到 窦糖醉 一 一术胶糖fnv糖一，糖 肌 杨 一 掣”一”一akit19，靛基质一 硫 化 氢尿素写x试验忆试验动力马流产沙门氏菌以伤寒沙门氏菌肠炎沙门氏菌都柏林沙门氏菌。一申 一。-0。口矛。勿中由巾。丫O昌、(卫毋任妞 1。丫也丫，.。丫O丫。一一 一一 一一一一 丫一 J一 丫一 丫+一一，一+十-一 卜十注:阴性，十 阳性 弓产酸产气.丫不定3.3.5 抗原构造分析3.3.5 门操作方法 用铂金L l 自L 述的I M斜面上钓取培养物，于滴有生理盐水的载玻片上轻磨成乳剂，如无凝集现象，即认为鉴定的细菌无自凝性;此时、将钓取的细菌按以下顺序与滴加在载玻片1_ 的沙门氏菌属因子血 洁(见.i.2.9)棍介，做定性凝集试验，在2 m i n 内根据凝集情况.判定结果 而先川沙门氏菌属 A P群混合因子血清确定被检细菌是否沙门氏菌 在确定为沙门氏菌的基础J _，再了 打仁 代表%.5,义的 I-要()J I L 原因子血清如 2,4,7,8,9,3,1 0,1 1等 8 种分别做反应.确定其属于W I T 5 7 0-2 0 0 2哪 一 个血清群;确定 了血清群后，再根据 H抗原的不同，选用第相和第二相H因子血清做反应，进行分型3.3-5.2 结果判定 如与A-F群()因子血清凝集.定为沙门氏菌;-j()因子血清4 凝集定为I 3 群 第一相缺 与第二相I t 因子血清e,n,x 凝集，则 I I 抗原定为。n.x:抗原式为4.1 2-c.n.x.血清刑定为 今 流产沙门氏菌3-3.6 小鼠接种试验336 门操作方法 川注射器吸取流产胎儿胃内容物等标本()I m l 一。.2 m l 给小以腹腔注射，观察3 d 一5 d3.3-6.2 试验结果 小鼠在接种后的 I(1 一 3 d内死亡。根据需要可剖检，取脾脏等按 3.;.艺 做显微镜检查，按 3.3.3 分离培养 按 1.3.1 做生化特r a-鉴定和按 3米马 做抗原构造分析 然后根据 _ 述试验的阳性结果。川报告检出的是马流产沙门氏菌强 短 株1 应当洲意的足.在极个别情况 F.可能检出沙门氏菌的其他血清型 此时。叮根据农1 和表2的内容Y-以鉴别.表 2 细菌抗原构造 一血 ”又)沉)V.卜一下厂一-一-一一 第利 丁第二相第二相“一马 流 产 沙 门 氏 菌“R A 寒 沙 氏 菌Iu一 肠 炎 沙 门 ft MI)一 邵 柏林沙门氏菌点.12.12.1.9.121.9.12，R-一一 一一1.233，了 综合判定 根据以!所检细菌的形态特征及培养性状，初步报告检出J 沙门氏菌 根据细菌的生化特性和抗原构造，报告检出 了 马流产沙门氏菌。根据小鼠接种试验的结果，报告检出的 今 流产沙门氏菌为强毒株4 血清学检查4 门试管凝集试验4 门门器材 恒温箱、试 竹架、酒精灯、铂金 耳、剪毛 剪、采血钊、煮沸消 毒器,1 3 m m,.I 1 0 m m反应管,1 2 0 m m X1 5。m m玻璃板、。.1 m l I.0 m l-2.0 m l.及5.0 m l吸管、微敲加样器、牙鉴、火柴杆等4 门.2 诊断液 ;!j 流产凝集试验抗原与阴性、阳性血清。4.1.3 稀释液 o.:,i 1 苯酚(俗称石炭酸)生理盐水，称取。.8 5 9氯化钠(化学级)、().;9石炭酸(化学级)，加蒸馏水至1 0 0 m l，溶解、过滤，以1 0 3.4 1 k P a.岛压蒸汽灭菌4.1.4 消毒液 3 叮来苏儿、5%石炭酸、。.1%新洁尔火、2 叮碘洒、Z S%S 酒精4 门.5 被检血清 石被检马 左侧颈沟:5 之 一 处剪毛，用 3 来苏J L.5 万碘洒和7 乃 s洒精依次消i 切r i,自颈静脉采血约几 ml泪人试竹中，凝囚后，分离血清，待检4 门.6 操作方法4 门.6 门试验步骤 取小反应i i(i 支，按表 1 排成一列 除第一支川代被检血洁的稀释外、其余 5支分别标明工 2 0 0,N v/T 5 7 0-2 0 0 21:4 0 0,1:8 0 0,1:1 6 0 0 及对照(每次检验只做一管)字样，置于试管架 卜然后用吸管吸取 0.5 写石炭酸生理盐水，除第一管和第二管各加 1.8 ml外，其余4 管均加 1 m 工 J，再用 1-I吸管吸取被检马血清0.2 ml.加至第一骨中，混合后，即为 1:1。稀释，由此管吸取稀释的血清ll.2 M I加至第二管中，混合后，即为 1:1 0 0 稀释，以后由第二管吸取 1 m工加人第三管，混合后吸出 1 MI _ 加至第四管，依此逐次至第五管，混合后，吸出1 m l弃去。其稀释度分别为1:2 0 0,1，4 0 0,1:8 0 0 0第六管为对照，不加血清。然后在第二、丫、四、五、六各管内分别滴加 1:扣 稀释的抗原 1 m工，充分振荡混合后，各管的血清稀释度即分别提高一倍，成为 I:2 0 0,1:4 0 0,1:8 0 0 及 1:1 6 0 0最后将反应管置 1 7 C 恒温箱内感作2 4 h,取出，判定反应强度(见表 3)表 3 马流产沙门氏菌病试管凝集试验操作方法要素/mL被检马血清最终稀释倍数对照1:1 0 1:2 0 0 1:4 0 0 1:8 0 0 1:1 6 0 0。.5%石炭酸生理盐水 被检血清 1:2 0 抗原F-1.8F-0.2口 )口 )一 口 )州.0 l0 1.01.01.0振摇混匀后，里 3 7 恒温箱中感作 2 4 h,判定结果结果(例)阴性反应疑似反应阳性反应+十+一十+十+十十+注:凝集强度的判定见4.1.6.2.4 门.6.2 凝集强度判定标准 按凝集的有无及凝集强度，分别用+、+、+于、+、一等记号作记录，具体是:+”管底有多量紧密边缘整齐或不整齐的凝集物沉淀，上部液体完全透明(即 1 0 0%的菌体凝集)振荡后，管底沉淀呈颗粒