DB35T 1280-2012 大豆疫霉菌分子检测技术规程.pdf

ICS 65.020 B16 DB35 福建省地方标准 DB35/T 12802012 大豆疫霉菌分子检测技术规程 Standard protocol for molecular detection of Phytophthora sojae 2012-11-02 发布 2013-02-01 实施福建省质量技术监督局 发 布 DB35/T 12802012 I 目 次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 材料与试剂.1 5.1 主要仪器与器材.1 5.1.1 PCR 检测仪.1 5.1.2 凝胶成像仪.2 5.1.3 台式离心机.2 5.1.4 涡旋混匀器.2 5.1.5 电泳仪.2 5.2 主要试剂.2 5.2.1 苯酚；氯仿；异戊醇；乙醇.2 5.2.2 二甲基亚砜.2 5.2.3 氢氧化钠.2 5.2.4 脱脂奶粉.2 5.2.5 PCR 常规试剂.2 6 采样.2 6.1 采样工具.2 6.2 样品采集.2 6.2.1 大豆植株.2 6.2.2 土壤.2 6.3 样品贮运.2 6.4 样品存放.2 7 操作方法.2 7.1 样本 DNA 制备.2 7.1.1 植物组织中病原菌 DNA 的提取.2 7.1.2 土壤中 DNA 的提取.3 7.1.3 DNA 的保存.3 7.2 检测.3 7.2.1 加样.3 7.2.2 PCR 检测.3 7.2.2.1 反应体系.3 7.2.2.2 反应条件.3 DB35/T 12802012 II 7.2.3 套式 PCR 检测.3 7.2.3.1 套式 PCR 模板 DNA 制备.3 7.2.3.2 套式 PCR 反应体系.3 7.2.3.3 套式 PCR 反应条件.4 7.3 琼脂糖凝胶电泳.4 8 结果判定.4 8.1 PCR 检测结果判定.4 8.2 套式 PCR 结果判定.4 9 样品处理.4 附录 A（资料性附录）大豆疫霉菌样本检测报告.5 附录 B（资料性附录）大豆疫霉 PCR 检测试剂.6 DB35/T 12802012 III 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的要求编写。本标准由福建省农业厅提出并归口。本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：陈庆河、翁启勇、李本金、兰成忠、赵健、邱荣洲。DB35/T 12802012 1 大豆疫霉菌分子检测技术规程 1 范围 本标准规定了大豆疫霉菌PCR检测的样品制备、检测技术和操作程序。本标准适用于大豆植物组织及土壤中大豆疫霉菌的分子检测。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 巢式 PCR（nested PCR）是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性，又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的特异性。3 原理 大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)隶属鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科，疫霉属。真核生物核糖体基因包括5、5.8、18、25在内的4个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列，由于其进化速率慢，常用于探讨科级和科级以上等级的分类、检测和鉴定。核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer ITS)是介于18S rDNA、5.8S rDNA和25S rDNA之间的区域，该区域进化速率较编码区快，研究表明ITS在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为病原菌的分子检测提供理想的靶序列。根据大豆疫霉菌ITS的特异序列，合成一对特异性引物，获得大豆疫霉菌特异性扩增片段，用于大豆疫霉菌的快速分子检测。4 材料与试剂 4.1 主要仪器与器材 4.1.1 PCR 检测仪 4.1.2 凝胶成像仪 4.1.3 台式离心机 4.1.4 涡旋混匀器 4.1.5 电泳仪 DB35/T 12802012 2 4.2 主要试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。4.2.1 苯酚；氯仿；异戊醇；乙醇 4.2.2 二甲基亚砜 4.2.3 氢氧化钠 4.2.4 脱脂奶粉 4.2.5 PCR 常规试剂 5 采样 5.1 采样工具 分样套筛、剪刀、镊子、1.5 mL微量离心管、研钵。5.2 样品采集 5.2.1 大豆植株 采集疑似大豆疫病的植株根部及地表上2cm4 cm的茎部样品。5.2.2 土壤 每块大豆田随机选5个点，取2cm15cm深度的50g土壤样品。5.3 样品贮运 样品采集后，放入密闭的容器内，送实验室。将取样结果进行记录，记录表格见附录A。5.4 样品存放 处理的样品应保存在-20 以下，避免反复冻融。6 操作方法 6.1 样本 DNA 制备 6.1.1 植物组织中病原菌 DNA 的提取 取一段疑似病株组织，每毫克加入10 l 0.5 M NaOH，在研钵中充分研磨后移至1.5 ml的离心管中，12000 r/min离心5 min，取5 l上清液加入495 l 0.1 mM Tris（pH 8.0），混匀后取1 l直接用于PCR反应。6.1.2 土壤中 DNA 的提取 经100目过筛后的土壤加入少量无菌水（10g土壤约加入5ml无菌水）后冷冻抽干24h48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5 ml 离心管中，每管加入500 l 0.4%脱DB35/T 12802012 3 脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 r/min离心15 min。取上清液加入等体积浓度为20 g/ml蛋白酶K缓冲液，55水浴1h3 h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5 M NH4AC溶液，混匀。12000 r/min离心15 min。吸上清液加入2倍体积无水乙醇,-20沉淀1h，12000 r/min离心15 min，去除上清液，70%乙醇洗涤沉淀物，室温晾干。提取的DNA用10 lTE（或无菌超纯水）溶解，20保存备用。6.1.3 DNA 的保存 提取的DNA样品须在24 h 内进行PCR 扩增，长期保存须置于-70 冰箱中。6.2 检测 6.2.1 加样 在各设定的PCR管中分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照样品液。制备的DNA模板溶液各2L，加一滴石蜡油，盖紧管盖。6.2.2 PCR 检测 7.2.2.1 反应体系 PCR扩 增 使 用 引 物 PSD11 和 PSD12 序 列 分 别 为 5-TGAGGTGTCTTGCGGCGT-3 和5-AATTGAGATGCCACCTCCG-3。大豆疫霉菌PCR检测反应条件为：反应体积为25L，其中包括10 PCR buffer 2.5 l，10mol/L的引物对各0.2 l，MgCl2(5mM)2.5l，dNTPs（10mM）2.0l，Taq Polymerase 1U，DMSO 0.5 l，10梯度稀释的大豆疫霉菌基因组DNA作为阳性模板。阴性对照采用d.d.H2O，待测样品按照6.1所述方法制备。7.2.2.2 反应条件 PCR扩增程序：94预变性3min，94变性1min,68退火30sec,72延伸1min,35 个循环，最后72延伸10min。6.2.3 套式 PCR 检测 7.2.3.1 套式 PCR 模板 DNA 制备 分别取第一轮PCR产物原液、10倍稀释液和100倍稀释液，三个浓度作为套式PCR扩增的DNA模板。7.2.3.2 套式 PCR 反应体系 套式PCR扩 增 使 用 引 物 PSNF 和 PSNR 序 列 分 别 为 5-CGTTGTTGGTTGTGGAGG-3 和5-CTCACACAGCTACGGTTC-3。套式PCR检测反应条件为：反应体积为25L，其中包括10 PCR buffer 2.5 l，10mol/L引物对各0.2 l，MgCl2(5mM)2.5l，dNTPs（10mM）2.0l，Taq Polymerase 1U，大豆疫霉菌基因组DNA作为阳性模板，阴性对照d.d.H2O（见附录B）。待测样品按照6.2.3.1所述方法制备。7.2.3.3 套式 PCR 反应条件 PCR扩增程序：94预变性3min，94变性30sec,65退火30sec,72延伸30sec,35 个循环，最后72延伸7min。6.3 琼脂糖凝胶电泳 DB35/T 12802012 4 将10 l PCR产物用重量浓度1.5%琼脂糖电泳分离（电压为8V/cm，时间为45min），经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果；如果未见到一条清晰的分子量为382bp的特异条带，进一步用套式PCR检测：套式PCR扩增后将10 l PCR产物用重量浓度1.5%琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果：7 结果判定 7.1 PCR 检测结果判定 当阳性对照出现382bp条带、而阴性对照未出现条带时，所测样品出现382 bp条带,判定所测样品检出大豆疫霉菌；当所测样品未出现382 bp条带，需将PCR产物进一步进行套式PCR反应，以便对样品是否带大豆疫霉菌进行判断。7.2 套式 PCR 结果判定 当阳性对照出现173bp条带、而阴性对照未出现条带时，所测样品出现173 bp条带,判定所测样品检出大豆疫霉菌；当所测样品未出现173 bp条带，判定所测样品未检出大豆疫霉菌。8 样品处理 鉴定为带有大豆疫霉菌的样品于-20冰箱中保存至少6个月，以备复检、谈判和仲裁等，保存期满后须进行灭活处理 DB35/T 12802012 5 A A 附 录 A（资料性附录）大豆疫霉菌样本检测报告 编号：样品种类 取样时间 取样地点 样品数量 取样部位 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测鉴定方法：检测鉴定结果：备注：检测人（签名）：审核人（签名）：检测单位盖章：年 月 日 注：本单一式两联，第一联送检单位存档，第二联检测单位存档。DB35/T 12802012 6 B B 附 录 B（资料性附录）大豆疫霉 PCR 检测试剂 PCR检测反应试剂配方：PCR检测反应试剂配方：10PCR缓冲液2.5l，25mmol/L MgCl2 2.5l，10mmol/L dNTPs 2.0l，10umol/L 引物各 0.2l，Taq DNA聚合酶 1.0U，二甲基亚砜 0.5l，待测样品 1l，加灭菌ddH2O至 25L _